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Apr 07, 2023

現在のマイクロプラスチック汚染レベルは野生の海鳥の腸内マイクロバイオームに影響を与えている

ecologia ed evoluzione naturale

Nature Ecology & Evolution volume 7、pages 698–706 (2023)この記事を引用

8271 アクセス

2 引用

692 オルトメトリック

メトリクスの詳細

マイクロプラスチックは世界中の環境を汚染し、多数の生物種に摂取され、その健康にさまざまな形で影響を与えています。 影響を受ける可能性のある健康の重要な側面は腸内微生物叢ですが、これらの影響は比較的解明されていません。 今回我々は、マイクロプラスチックを慢性的に摂取する2種の海鳥、キタフルマとコリーミズナギドリにおいて、マイクロプラスチックが前胃および総排出腔のマイクロバイオームの変化と関連しているかどうかを調査した。 腸内のマイクロプラスチックの量は、腸内微生物の多様性および組成と有意に相関していた。マイクロプラスチックは、共生微生物叢の減少、（人獣共通）病原体および抗生物質耐性微生物やプラスチック分解微生物の増加と関連していた。 これらの結果は、環境に関連したマイクロプラスチックの濃度と混合物が野生の海鳥の腸内マイクロバイオームの変化と関連していることを示しています。

マイクロプラスチックは、野生動物と人間の健康に対する新たな脅威となっています1,2。 これらの小さな (<5 mm) プラスチック粒子は、水域、土壌、空気を汚染します1,3。 マイクロプラスチックが遍在することにより、人間を含む、暴露された動物に対する潜在的な健康への悪影響を特定することを目的とした広範な研究が促進されています1,3。 研究により、マイクロプラスチックが動物とその健康に悪影響を与える可能性があることが実証されています3。 このような研究にもかかわらず、マイクロプラスチックの摂取が腸内マイクロバイオームコミュニティに及ぼす影響についての理解は不十分です。

マイクロバイオームは、宿主種と進化的共生関係を形成した、体の所定の領域に存在する微生物の集合体です4。 したがって、マイクロバイオームは宿主の栄養、生理学、免疫機能、発達、さらには行動にとって不可欠であり、多くの病気は腸内マイクロバイオームの変化と関連しています5。 環境汚染などの人為的ストレス要因にさらされた動物では、マイクロバイオームの分類学的および機能的多様性が変化する可能性があります6,7。 これに沿って、実験室研究では、マイクロプラスチックが腸内微生物叢に変化を引き起こし、健康に悪影響を与える可能性があることが明らかになりました8、9、10。 しかし、この分野はまだ初期段階にあるため、野生個体群におけるマイクロプラスチックの影響はまだわかっていません。 マイクロプラスチック汚染のレベルは時間の経過とともに上昇し、蓄積すると予想されることを考慮すると11、腸内マイクロバイオームに反映される野生動物の健康がどのような影響を受けるかを理解することが不可欠です。

この記事では、我々は、2 つの異なる海鳥種における、さまざまな程度のマイクロプラスチック摂取に対する腸内微生物の反応を研究しました。これは、ポルトガルのアゾレス諸島で収集されたコリーミズナギドリ (Calonectris borealis)、n = 58 個体、および北フルマ (Fulmarus glacialis)、n = 27 個体、カナダのバフィン湾で収集。 それらの分布は両半球にまたがっています (拡張データ図 1)。 どちらの種もプラスチックの破片を摂取し、特にフルマルはプラスチックの生物指標として確立されています12、13、14、15。 腸内マイクロバイオーム（鳥では通常総排出腔のサンプリングによって決定される）のみから焦点を拡大し、前胃のマイクロバイオームも含めることにより、我々はさらに、マイクロプラスチックの摂取が消化管のマイクロバイオーム（GIT）に同様の影響をもたらすかどうかを決定することを目的とした。 ）消化管に沿って進行します。 16S リボソーム RNA 遺伝子配列決定を使用して、データセット全体で最も豊富な門は、プロテオバクテリウム属 (49.9%)、ファーミクテス属 (33.1%)、アクチノバクテリオタ属 (6.2%)、フソバクテリオタ属 (4.2%)、およびバクテロイド門 (3.7%) であることがわかりました。拡張データ図. 2)、4,602,578 件の読み取りの 97% 以上を占めました。

線形混合モデルを使用し、他の生物学的変数および実験変数を考慮して（補足結果）、前胃の微生物のアルファ多様性（アンプリコン配列変異体（ASV）の観察数、シャノン指数、フェイスの系統学的多様性（PD）およびアレンのHメトリクス）かどうかをテストしました。そして、2つの種の総排泄腔マイクロバイオームはマイクロプラスチック（数と質量、補足結果）と関連しており、相互作用項を含めることによって、マイクロプラスチックの影響が海鳥の種間および胃腸管全体で同様であるかどうかを調べました。 すべてのアルファ多様性指標において、マイクロプラスチック数は前胃における微生物のアルファ多様性と有意に正の相関があった（観察された ASV 数: β = 0.67、t81 = 2.96、P = 0.004、シャノン指数: β = 0.27、t81 = 2.85、P = 0.006; フェイスの PD: β = 1.68、t81 = 3.46、P < 0.001; アレンの H メトリック: β = 0.07、t81 = 2.73、P = 0.007; 図 1、拡張データ図 3 および補足表 1)。 これらの関連性は総排出腔よりも前胃で有意に大きかった（観察されたASV数：P = 0.011、フェイスのPD：P = 0.001、シャノン指数の傾向：P = 0.084およびアレンのH測定基準：P = 0.089）。効果はゼロに近かった(観察されたASV数: β = 0.01; シャノン指数: β = 0.08; フェイスのPD: β = −0.06; アレンのH測定基準: β = 0.02)。

a〜f、各ドットは、胃腸内（青い点、n = 85）または総排出腔マイクロバイオーム（オレンジ色のドット、n = 84）のいずれかに由来する、GIT内の位置によって色付けされたマイクロバイオームサンプルを表します。 アルファ多様性メトリック: 観察された ASV の数 (アルファ多様性値の平方根変換によりスケールが非線形であることに注意してください) (a および b)、シャノン指数 (c および d) およびフェイスの PD (e および f) MP 数の比率 (MP 数/鳥の個体質量、左) と MP 質量の比率 (MP 質量/鳥の個体質量、右) との関係でプロットされています。 各プロットの線は、そのアルファ多様性メトリックの線形混合モデルに基づく予測値を示し、線の両側にある影付きの領域は、95% 信頼区間の上限と下限を示します。

マイクロプラスチックの質量との関係では、マイクロプラスチックの質量が大きい鳥はシャノン指数 (β = −0.20、t81 = −2.38、P = 0.020)、信仰の PD (β = −1.12、t81 = −2.47、P = 0.016) が有意に低かった。アレンの H メトリクス (β = −0.06、t81 = −2.54、P = 0.013)、および前室マイクロバイオームにおける観察された ASV 数との傾向的な負の相関 (β = −0.40、t81 = −1.95、P = 0.055)図1および補足表1)。 これらの関連性は、フェイスの PD (P = 0.006) とアレンの H メトリクス (P = 0.020) を考慮すると、前胃マイクロバイオームと総排泄腔マイクロバイオームの間で大きく異なり、観察された ASV 数 (P = 0.073) とシャノン指数 (P = 0.073) の傾向を示しました。 0.090）。 総排泄腔では、前胃とは対照的に、フェイスの PD との関連性は陽性 (β = 0.36) でしたが、観察された ASV の数 (β = 0.05)、シャノン指数 (β = −0.02) ではゼロに近かったです。 ) およびアレンの H 計量 (β = 0.01)。 外れ値（最初の百分位未満または 99 番目の百分位より大きい）と考えられるサンプルを削除しても、結果は実質的に変わりませんでした（補足表 2）。 同様に、鳥の質量で標準化せずにマイクロプラスチックの数または質量を使用したモデルも結果を実質的に変更しませんでした（補足表3）。

一般に、マイクロプラスチックの数と質量はどちらもアルファ多様性と有意に（それぞれ正と負）相関しており、後方（総排出腔）よりも前方（腹室）の相関が大きく、微生物のアルファ多様性に対するマイクロプラスチックの影響は、微生物が体内を移動するにつれて弱まることが示唆されています。ギット。 マイクロプラスチックが病原性微生物や外来微生物のベクターとして機能する場合 2,16、ヒッチハイク中の微生物がより多くの常在微生物と接触して競合し、重なり合う宿主の免疫防御を乗り越えなければならないため、この作用機序は胃腸管に沿って減少する可能性があります 17。 さらに、疎水性有機化学物質の媒介としてのマイクロプラスチックの役割は依然として不明瞭であるが 18、最近の研究では、人工腸液中でのマイクロプラスチックの脱着は時間の経過とともに指数関数的に減少し 19、高温および低 pH でより高くなることが示されている (参考文献 20)。ニワトリで最も少なく、腹部で最も少ない21。

マイクロプラスチックが微生物ベクターとして機能する可能性があるという結論をさらに裏付けるものは、フェイスのPDが最大の変動量を説明し（補足結果）、マイクロプラスチックの影響を最も受けたという観察でした。 これは、マイクロプラスチックが、より多くの微生物を胃腸管マイクロバイオームに導入するだけでなく（豊富さの増加を反映して）、異なる進化系統に由来するより多様な微生物も導入できることを示唆しています。 特に、マイクロプラスチックの量がどのように測定されたかによって、胃腸管マイクロバイオームに対するマイクロプラスチックのさまざまな潜在的な影響が明らかになりました。 マイクロプラスチック数は一般にアルファ多様性と正の相関があったが、マイクロプラスチック質量は一般に負の相関があった。 マイクロプラスチックの数はベクトルとして機能することでアルファ多様性を増加させる可能性がありますが 2,16、マイクロプラスチックの質量は体積と密度を考慮し、後者はポリマーの種類と特性によって影響を受ける可能性があります 22。 したがって、質量はおそらくカウントよりもポリマー特性の違いを反映していると考えられます。 プラスチックポリマーには抗菌添加剤を添加できるため 22、そのようなポリマーの質量が増加すると微生物のアルファ多様性が減少する可能性があります。 これらの違いを解析するには、マイクロプラスチックポリマーの種類とその添加剤についてのより多くの知識が必要であり、将来の研究のための豊かな道と思われます。

モデルの選択では、マイクロプラスチック (数と質量) と宿主海鳥種の間の相互作用は裏付けられませんでした (方法)。 したがって、マイクロプラスチックと腸内微生物のアルファ多様性の間の相関関係は、キタフルマとコリーミズナギドリの間で同様でした。 これは、この研究で観察された効果が、マイクロプラスチックを摂取するプロセラリ目において広く適用される可能性があることを示唆しています。

次に、マイクロプラスチックが個体間の胃腸管の微生物組成と相関するかどうか（ベータ多様性）、そしてこれらの相関関係が海鳥の種間および胃腸管全体で同様であるかどうかを調査しました。 これは、vegan::adonis に実装された 9,999 個の順列を持つ順列テストを使用して行われました (補足結果)23。 視覚化の目的で、マイクロプラスチックの結果は主座標分析 (PCoA) プロット (拡張データ図 4 ～ 8) にプロットされました。これは一度に 2 次元のみを表すことができますが、これらの統計結果はすべての次元にわたって評価されました。ベータ多様性行列。 マイクロプラスチック数を考慮する場合、重み付け (P < 0.001) および重み付けなし (P < 0.001) の UniFrac 距離、および組成データに対する Aitchison の対数比アプローチ内のユークリッド距離 (P < 0.001) を使用すると、数がベータ多様性と有意に相関していることがわかりました。 0.001; 拡張データ図 4 および補足表 4)。 しかし、これはGIT内のマイクロバイオームの位置（重み付けされたUniFrac: P = 0.008; 重み付けされていないUniFrac: P < 0.001; Aitchison: p = 0.001; 拡張データ図5）だけでなく、宿主海鳥の種（重み付けされたUniFrac）にも依存しました。 UniFrac p = 0.043; 重み付けされていない UniFrac: p < 0.001; Aitchison: P < 0.001; 拡張データ図 6 および補足表 4)。 これは、マイクロプラスチック数が前胃と総排出腔、および種間のベータ多様性と異なる関連性を持っていることを意味します。

マイクロプラスチックの数から質量に移ると、重み付けされていない UniFrac 距離 (P < 0.001) および Aitchison のアプローチ (P < 0.001) を使用した場合、質量はベータ多様性と有意に相関し、重み付けされた UniFrac 距離 (P = 0.069; 拡張データ) を使用した場合の傾向が判明しました。図4）。 これは、重み付けされたUniFrac距離（P = 0.016;拡張データ図7a、b）およびAitchisonのアプローチ（P = 0.011;拡張データ図7e、f）を考慮した場合、GIT内のマイクロバイオームの位置、および宿主に依存しました。調査対象の種（重み付けされた UniFrac：P < 0.001、重み付けされていない UniFrac：P < 0.001、Aitchison：P < 0.001、拡張データ図 8 および補足表 4）。 その結果、マイクロプラスチックの質量は、重み付けされた UniFrac 距離と Aitchison のアプローチを考慮した場合にのみ、前胃および総排出腔の微生物組成と異なる形で関連付けられましたが、重み付けされていない UniFrac 距離では関連付けられませんでした。 さらに、この関連性は問題の宿主種に依存していました。 鳥の質量で標準化せずにマイクロプラスチックの数または質量を使用したモデルの結果も同様の結果を示しました（補足表5）。 私たちが調査した宿主種は離れた場所で収集され、異なる属に属し、異なる年齢層（成体と雛）を代表するものであるため、それらのGITマイクロバイオーム組成が異なることは驚くべきことではありません24。これは、シフト可能な微生物分類群が異なる可能性があることを意味します。同じ。 野生動物の腸内マイクロバイオームに対するマイクロプラスチックの影響の調節における宿主の系統発生、年齢、地理的位置の役割を解明するには、今後の研究が必要となるだろう。

どの分類群がマイクロプラスチックと微生物のベータ多様性との関連性を推進しているかを理解するために、ANCOMテスト25を実行しました。これにより、17のASVが異なって豊富であることが決定されました（図2および補足結果）。 これらのうち、10 件はマイクロプラスチックの数と関連しており (図 2a)、5 件はマイクロプラスチックの質量と関連していました (図 2b)。 Catellicoccus 属、Cetobacterium 属、および Pseudoalteromonas 属は、マイクロプラスチック数とマイクロプラスチック質量の両方に関連していました。 注目すべきことに、マイクロプラスチック数が増加するにつれて、健康な宿主に関連する常在微生物叢の量が減少する一方で、病気、抗生物質耐性、プラスチック分解に関与することが知られている微生物や人獣共通感染症の病原体と考えられる微生物の量が増加しました。 例えば、通常は健康な生物に関連する海洋細菌で構成されるシュードアルテロモナス26は、サイクロバクター26,27、エンテロコッカス28,29、カテリコッカス30,31、ブドウ球菌32,33などの(海)鳥微生物叢の既知のメンバーと同様に、マイクロプラスチック数と負の相関があった。 。 対照的に、コリネバクテリウム乾癬はマイクロプラスチック数と正の相関があり、人獣共通感染症となる可能性のある新興病原体として同定されており 34,35 、その属はプラスチックを分解する能力を示している（参考文献 36 のデータベース）。 さらに、Lactobacillus aviarius は鳥類微生物叢の一般的なメンバーですが 37、存在量の増加は鳥類の発育不良を示しています 29。 マイクロプラスチック数と正の相関があったのは、ヒトの結腸直腸がんの予測因子であるパルビモナス菌38と、抗生物質バンコマイシンに耐性のあるセトバクテリウム菌39でした。 ウェルシュ菌は、マイクロプラスチック塊と最も大きな正の関連性があり、総排泄腔マイクロバイオームと前胃マイクロバイオームとのより大きな関連性があり、鶏の壊死性腸炎や生命を脅かすガス壊疽や食中毒を引き起こす可能性のある細胞外毒素を産生するニワトリの病原体です。人間40． マイクロプラスチック塊に関連する他の潜在的な病原体は、Fusobacterium 41 および Edwardsiella 42、43 でした。

a ～ e、各ドットは、y 軸上の分類学的割り当てによって、x 軸上の中心対数比 (clr) 係数の降順でプロットされた ASV を表します。 したがって、中心ゼロの右側のドットはマイクロプラスチックと正の相関を示し、左側のドットは負の相関を示します。 プロットされた ASV は、マイクロプラスチック数 (a)、マイクロプラスチック質量 (b)、マイクロプラスチック数とサンプルの種類の相互作用に従って、ANCOM (w0 = 0.70) によって差次的に豊富であると特定されました (青い点は前胃を表し、赤い点は総排出腔を表します)。 (c)、マイクロプラスチックの質量とサンプルの種類の間の相互作用 (青い点は前胃を表し、オレンジ色の点は総排泄腔を表します) (d)、およびマイクロプラスチックの数と種の間の相互作用 (緑の点はコリーミズナギドリを表し、紫色の点はキタフルマを表します) ( e)。 ANCOMは、17種類の豊富なASVを特定した。 ただし、17 個の ASV のうち 3 個がマイクロプラスチック数 (a) およびマイクロプラスチック質量 (b; Catellicoccus sp.、Cetobacterium sp.、Pseudoalteromonas sp. として注釈が付けられている) に関連付けられており、1 つの ASV が両方に関連付けられているため、ここでは 21 個の点が表示されています。マイクロプラスチックの質量 (b) と、マイクロプラスチックの数とサンプルの種類の間の相互作用 (c; Edwardsiella sp. として注釈が付けられています)。

Cetobacterium 属と Fusobacterium 属は、北西アドリア海から救出された飼育下アカウミガメ (Caretta caretta) のプラスチック摂取にも関連していました 44。 これは、マイクロプラスチックが腸内微生物群集に同様の影響を及ぼしている可能性を示唆している。これは、今回の研究で対象とした海鳥のような近縁種間だけでなく、同様の環境に生息する遠縁種間でも同様である。

合計17個の異なって豊富なASVのうち、3個はマイクロプラスチック数と胃腸管の位置の間の相互作用と負の関連がありました（図2c;フラビフレクサス、エドワードシエラ、コリネバクテリウム）。 2つのASVは、マイクロプラスチックの塊とGITの位置の間の相互作用に関連していました：クロストリジウム・パーフリンジェンスは正の相関があり、アシネトバクターは負の相関がありました（図2d）。 両方の ASV について、相関の大きさは、胃腸マイクロバイオームより総排泄腔の方が大きかった。 ANCOMは、カテリコッカス属に属する1つのASVが、マイクロプラスチック数と宿主海鳥種の間の相互作用に負の関連があることを明らかにしましたが、マイクロプラスチック塊と宿主種の間の相互作用に関連するASVはありませんでした（図2e）。

私たちは、個々の足根骨の長さと体重を使用して計算されたスケーリングされた質量指数を使用して、マイクロプラスチックの影響が宿主の体の状態に関連付けられているかどうかを調査しました。 しかし、身体状態の唯一の有意な予測因子は、宿主種（β = −0.76、t = -3.98、p =< 0.001）および種とマイクロプラスチック数間の相互作用（β = −0.94、t = −3.62、P ≤ 0.001）でした。 ）、マイクロプラスチック数だけではありません（補足表6）。 したがって、マイクロプラスチックが宿主の健康に与える可能性のある影響は、私たちの身体状態の測定では捕らえられませんでした。 さらに、体の状態は、どのアルファ多様性モデルでも有意な予測因子ではありませんでした (補足表 7)。 私たちのベータ多様性モデルでは、身体状態は重み付けされていない UniFrac (P = 0.007) および Aitchison 距離 (P < 0.001; 補足表 8) を有意に予測しました。 したがって、マイクロプラスチックは微生物の組成の側面と関連しているものの、マイクロプラスチックが微生物の変化を引き起こすメカニズムは体の状態と関連しているようには見えません。

要約すると、摂取したマイクロプラスチックが海鳥の胃腸全体の微生物の多様性と組成と相関していることがわかりました。 マイクロプラスチックとアルファ多様性との関連は宿主海鳥の種には依存しなかったが、ベータ多様性との相関は宿主種に特異的であった。 マイクロプラスチックは、前胃マイクロバイオームと総排出腔マイクロバイオームとより大きな相関関係がありました。 さらに、マイクロプラスチックの増加は、共生微生物叢の減少、および（人獣共通感染症）病原体および抗生物質耐性微生物およびプラスチック分解微生物の増加と関連していた。 これらの結果は 16S rRNA 遺伝子配列決定から得られたものであり、菌株レベルでの分類学的同一性の達成や微生物の機能の同定という点では限界があることに注意しますが、我々の研究は、慢性的なマイクロプラスチック摂取が腸内細菌叢の異常と関連しているという以前の予測を裏付けています 2。

私たちの研究は、環境に関連したマイクロプラスチックの濃度と混合物が腸内微生物の多様性と相関していることを示しており、大規模な移動経路を持ち、野生でマイクロプラスチックの破片を摂取することが知られている遠隔地に生息する野生の海鳥における腸内細菌叢の異常の可能性を強調しています12、13、14。 北フルマルはマイクロプラスチック汚染の生物指標としてよく知られています45。 私たちの結果は、特にマイクロプラスチックがプロセラリ目の体内で数週間または数か月保持され、したがって最後の食事に完全に依存する可能性が低いことを考慮すると、慢性曝露によるマイクロプラスチックの累積的な悪影響を調べることができる将来の研究の基礎を提供します46。 その影響は広範囲に及ぶ。その一つとして、人間もマイクロ（およびナノ）プラスチックに曝露されており47、48、49、人間とその（腸内）健康がプラスチックの摂取によってどのような影響を受けるかという疑問が生じている。 もう 1 つは、腸内マイクロバイオームが宿主の健康において中心的な役割を果たしており、グローバル化した世界で人獣共通感染症と野生動物の健康状態がますます注目を集めるにつれて 50、将来起こり得る人獣共通感染症の原因と起源の探索が重要性を増しているということです。

この研究は、アゾレス諸島（ポルトガル）の北大西洋の亜熱帯循環の端にあるコリーミズナギドリ（C. borealis）と、キキクタルジュアク近郊の北のフルマル（F. glacialis）をそれぞれ監視する、進行中の2つのプロジェクトの枠組みの中で実施されました。北西大西洋のヌナブト準州 (拡張データ図 1; BirdLife International51)。 どちらの種もプロセラリ科に属し、地表摂食動物であり、マイクロプラスチックの破片を摂取します12、13、14、52、53。 キタフルマの採集は、2018 年 7 月から 8 月の繁殖期に行われました。合計 27 頭のキタフルマの成虫が繁殖地から射殺されました13。 コリーミズナギドリの採集は、巣立ちの時期に行われた。この時期は、ヒナが巣を離れるときに建物や他の人工構造物に衝突することが知られているが、これは多くの場合、死に至る可能性のある人工的な夜の光害に対する過敏症が原因である。 その後、2017年10月から11月と2018年の間にアゾレス諸島のコロニー近くで新鮮な雛の死体が収集されました。鳥は解剖とマイクロバイオームのサンプリングの時まで-20℃で冷凍され、合計58羽の雛が収集されました。

収集された海鳥は、標準化されたプロトコルに従って無菌条件下で解剖され、サンプリングされました15,54。 このプロトコールに加えて、滅菌綿棒を使用して各鳥の前胃および総排出腔をサンプリングした（ただし、誤って前胃で 1 回だけサンプリングされたキタフルマ 1 羽の個体を除く）。 各スワブを核酸保存緩衝液 55 に入れ、DNA 抽出まで -20 °C で保存しました。 胃腸管から 1 mm のふるいを通して収集されたプラスチック片を収集し、光学顕微鏡で検査し、参考文献に概説されているプロトコルに従って特徴付けました。 56. 測定されたすべての破片が 5 mm より小さいわけではありませんが、簡潔にするために、このプラスチックの破片をマイクロプラスチックと呼びます (Rodríguez et al.、準備中)13。 したがって、85 匹の海鳥のそれぞれの個体について、個体の体重と足根骨の長さ、胃腸内のマイクロプラスチックの数と総質量 (精度 ±0.0001 g の天秤を使用)、および前胃に関するデータを収集しました。 (n = 85) および総排泄腔 (n = 84) のマイクロバイオーム。

製造業者のプロトコールに従って、Macherey-Nagel の NucleoSpin「土壌からの DNA」抽出キット (ドイツ) を使用して、スワブ全体からの DNA を抽出しました。 細菌細胞を機械的に溶解するための追加のビーズ叩解ステップがプロトコルに組み込まれました6。 このステップ全体を通じて、抽出試薬のみを含む 16 個の抽出ブランクが含まれ、その後、可能性のある汚染を特定して除去できるように配列決定されました。

DNA 抽出後、細菌プライマー 515F (5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3') および 806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3') (参考文献 57) を使用して、16S rRNA 遺伝子の V4 超可変領域をターゲットにしました。 Fluidigm シーケンシング化学 (Access Array System for Illumina Sequencing Systems、Fluidigm Corporation) を使用できるようにするためのフォワードプライマー (CS1-515F) およびリバースプライマーアダプター (CS2-806R)。 この標的領域を 2 つのポリメラーゼ反応連鎖ステップ (2 ステップ PCR、補足情報) で増幅し、このプロセス全体を通して PCR 試薬のみを含む PCR ブランクを確実に含めるようにしました。 最初のステップでは、抽出した DNA (5 ～ 10 ng) 1 μl、プールしたフォワードおよびリバースプライマー 1.5 μl (200 nM)、AmpliTaq Gold 360 Master Mix 5 μl、超純粋 dH2O 2.5 μl で構成される PCR 総量 10 μl を調製しました。以下の PCR 条件で実行します。初期変性は 95 °C で 10 分間。 95 °C で 30 秒間の変性、60 °C で 30 秒のアニーリング、および 72 °C で 45 秒の伸長を含む 40 サイクル。 72 °C で 7 分間の最終伸び。 PCR を確実に成功させるために、各サンプルのゲル電気泳動を実施しました。 2 番目の PCR ステップは、最初の PCR ステップで増幅した DNA 2 μl、プールしたフォワードおよびリバース バーコード プライマー 4 μl (400 nM)、AmpliTaq Gold 360 Master 10 μl、および超純粋 dH2O 4 μl を含む PCR 容量 20 μl で構成されました。前述したのと同じ PCR 条件下で 10 サイクル実行します。 バーコード付きサンプルをビーズ精製し (1:1 比)、定量し、8 nM にプールしました。 ドイツのウルム大学進化生態保全ゲノミクス研究所にある独自の社内 Illumina MiSeq シーケンス プラットフォームを使用して、合計 169 個のスワブ サンプル、16 個の抽出ブランク、および 5 個の PCR ブランクのペアエンド シーケンスを 1 回の実行で行いました。

Illumina MiSeq アンプリコンシーケンスから得られたリードは、DADA2 プラグインを使用して QIIME 2 (バージョン 2020.8.0) で処理され、ASV を生成しました58、59。 分類法には、ターゲット プライマー 60 を使用してトレーニングされた SILVA (バージョン 138) 分類器を使用して、QIIME 2 のclassify-sklearn 関数 (およびそのデフォルトの信頼値設定) が割り当てられました。 ドメインレベルで細菌に割り当てられていないASVは、葉緑体またはミトコンドリア配列として特定されたASVとともに除去されました。 参考文献に記載されているように、根付き系統樹を構築しました。 6. 系統樹、分類、および ASV テーブルとサンプル メタデータが R (バージョン 3.6.1) (参照 61) にインポートされ、phyloseq パッケージ (バージョン 1.28.0) (参照 62) を使用して phlyoseq オブジェクトが作成されました。その後の分析。

R では、最初に、合計 2,956 個の ASV のうち 185 個を含む抽出および PCR ブランクを調査しました。 これら 185 個の ASV のうち、93 個はブランクに特有のもので、その後除去されました。 除染パッケージ (バージョン 1.4.0) (参考文献 63) を使用し、その蔓延率に基づく汚染物質の特定とデフォルトのしきい値 0.1 を使用すると、さらに 18 個の ASV が汚染物質の可能性として特定され、除去されました。 次に、シーケンシング深度が 2,900 リード未満のサンプルを失敗とみなし、それらとサンプルに固有の ASV をデータセットから削除しました。 さらに、データセット全体にわたって 2% の有病率フィルターと 10 リードの存在量フィルターを適用して、シーケンスアーチファクトである可能性が高い非常にまれな ASV を除去しました。 これにより、254 個の ASV がデータセットから削除され、抽出および PCR ブランクからすべての ASV が削除されました。 フィルタリング後のデータセットは、2,517 ASV および 169 サンプルにわたる 4,602,578 リードで構成され、サンプルあたりの平均シーケンス深度は 27,234 ± 5,999 リードとなりました。

マイクロプラスチックが各個体に与える可能性のある影響をよりよく反映するために、各個体のマイクロプラスチック数と質量を体重で割ることにより、各個体の鳥の質量の割合としてマイクロプラスチック数と質量を表しました。ただし、マイクロプラスチック数または質量のみを使用した結果も示しています。鳥の質量で標準化せずに質量を測定します。 分析全体を通じてこれらの変数を使用しましたが、簡潔にするために、これらの変数をマイクロプラスチック数およびマイクロプラスチック質量と呼びます。

まず、以下の指標とパッケージを使用して個体内の微生物多様性 (アルファ多様性) を計算しました。PD を反映する Faith の PD (btools パッケージ、バージョン 0.0.1) (参考文献 64)。 シャノン指数 (loge)。微生物の豊富さと均一性の両方を考慮します。 豊富さを反映する、観察された ASV の数 (後者の 2 つは両方とも phyloseq パッケージを使用)。 そしてアレンの H 計量 65,66。 次に、nlme パッケージ (バージョン 3.1.141) (参考文献 67) の線形混合効果モデルを使用して、各アルファ多様性メトリクスを以下の関数としてモデル化しました: マイクロプラスチック数 (スケーリング) と GIT 位置 (腹部のいずれか) の間の相互作用または総排出腔）; マイクロプラスチックの塊（スケール化）とGITの位置の間の相互作用。 宿主海鳥の種。 およびシーケンスの深さ（スケーリング）。 我々は当初、腸内マイクロバイオームに対するマイクロプラスチックの影響が宿主種に特有のものであるかどうかをテストするために、マイクロプラスチック数（スケール化）と宿主海鳥種との相互作用に加え、マイクロプラスチック質量（スケール化）と宿主海鳥種との相互作用を含めました。 ただし、これら 2 つの相互作用のあるモデルは、相互作用のないモデルよりも適合度が低いだけでなく (赤池情報量基準 (AIC)、ΔAIC >2 を使用)、アルファ多様性メトリックに関係なく、どちらの相互作用も統計的に有意ではありませんでした (P < 0.05)。 。 したがって、我々はこれら 2 つの相互作用を最終モデルから削除し、説明因子として宿主鳥種のみを保持し、腸内微生物のアルファ多様性に対するマイクロプラスチックの影響はフルマミズナギドリとミズナギドリの間で同様であり、どちらの種にも特有のものではないと結論付けました。 さらに、個々の鳥の ID をランダム因子 (ランダム切片) として設定することにより、GIT の異なる点 (前腹部と総排出腔) で同じ個体を繰り返しサンプリングしたことによる非独立性を考慮しました。 最良のモデル適合は、観察された ASV の数とアレンの H メトリクスを平方根変換することによって得られました68。 残りの 2 つのアルファ ダイバーシティ メトリックは変換されませんでした。 参考文献に概説されているプロトコルに従って、モデルにvarComb分散構造を追加することにより、前胃マイクロバイオームサンプルと総排泄腔マイクロバイオームサンプル間のアルファ多様性の異なる分散を、モデルにvarComb分散構造を追加することでシーケンスの深さに応じた分散の違いを考慮しました。 68. 自動車パッケージ (バージョン 3.0.3) の分散膨張係数を使用して説明変数間の多重共線性をチェックしました (参考文献 69)。問題のある変数は見つかりませんでした 70。 各モデルの限界 (R2LMM(m)) および条件付き (R2LMM(c)) R2 値 71 は、piecwiseSEM パッケージ (バージョン 2.1.0) (参考文献 72) を使用して計算されました。

両方の海鳥種における胃腸微生物群集の組成を分析するために、重み付けおよび重み付けされていない UniFrac 距離に基づいて関数 phyloseq:: distance を使用して距離行列を生成しました。これは、これらがマイクロバイオーム データ用に特別に開発されたためです73。 さらに、Aitchison の対数比アプローチを組成データに適用しました 74。これは、疑似カウント 1 を追加した後、ASV テーブルを中心対数変換し、ユークリッド距離を使用して距離行列を生成することで構成されます。 次に、関数 vegan::adonis (バージョン 2.5-5) で実装された順列テストによる帰無仮説検定を使用して、微生物組成に対するマイクロプラスチックの影響をテストしました (参考文献 23)。 距離行列ごとに 1 つのモデル (重み付きおよび重みなし UniFrac、Aitchison) を定義し、前のセクションで説明したのと同じモデル式を使用し、「strata」引数内に設定された個々の鳥 ID を使用しました。 多次元データの結果を視覚化するために、重み付きおよび重みなしの UniFrac 行列に対して制約なしの順序付け手法 PCoA を使用し、関数 phyloseq::owned を使用した Aitchison のアプローチに対して主成分分析を使用しました。 離散的および連続的なマイクロプラスチック変数 (個数と質量) の影響を視覚的に表すために、最初の 2 つの配列軸に基づいて関数 vegan::envfit を使用して、これらを配列プロットにベクトルとして当てはめます。

どの微生物分類群がマイクロプラスチックに関連したベータ多様性の違いを引き起こしている可能性があるかを判断するために、マイクロバイオームの組成の分析（ANCOM）テストを実行しました25。 nlme パッケージから線形混合効果モデル機能を追加することで、前述と同じモデル式を使用して、どの ASV がマイクロプラスチックの数と質量、マイクロプラスチックと胃腸管の位置の間の相互作用、およびマイクロプラスチックと宿主の間の相互作用に関連しているかを決定しました。海鳥の種。 ゼロインフレはマイクロバイオーム データの特徴であり、この種の分析では誤った発見率につながる可能性があるため 25、追加のフィルターを適用して、少なくとも 15 のサンプルに存在する ASV のみを保持しました。 これにより、ASV の総数は 81 に減りました。次に、有意水準 0.05 を使用して ANCOM を実行し、複数のテストを補正する Benjamini-Hochberg 手順を適用する中程度の補正パラメーターを選択し 25、デフォルトのカットオフ値 w0 = 0.70 を使用しました。そのため、帰無仮説が 70% 以上の割合で棄却された ASV のみが、差次的に豊富であると判断されました。 差を付けて豊富な ASV をプロットし、どの ASV がマイクロプラスチックと正または負の相関があるかを示すために、組成データ分析用の QIIME 2 プラグイン q2-composition59 のコードを R で実行するように適合させ、線形混合モデルの実行からモデル パラメーター推定値を計算しました。中心の対数比変換された (clr) ASV テーブル内の各 ASV ペアの比率について。

宿主の体の状態、マイクロプラスチックの摂取、および宿主の腸内マイクロバイオームの間の関連性を調査するために、線形身体測定値として個々の足根骨の長さによるスケール化された質量指数を使用して、海鳥ごとの体の状態を計算しました75。 次に、マイクロプラスチックの数と質量、および性別や宿主種との相互作用によって説明される応答変数として、ガンマ対数分布と体の状態を備えた一般化線形モデルを使用しました。 次に、上記のアルファおよびベータ多様性モデルに、宿主の体の状態を説明変数として含めました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

配列データおよび対応するメタデータは、National Center for Biotechnology Information でアクセッション番号 PRJNA930758 として入手できます。 さらに、メタデータは GitHub (https://github.com/gfackelmann/Current-levels-of-microplast-pollution-impact-wild-seabird-gut-microbiomes) にも保存されます。

分析用のスクリプトは GitHub (https://github.com/gfackelmann/Current-levels-of-microplast-pollution-impact-wild-seabird-gut-microbiomes) に保存されています。

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ウルム大学が提供するオープンアクセス資金。

進化生態学および保全ゲノミクス研究所、ウルム大学、ウルム、ドイツ

グロリア・ファッケルマン & シモーネ・ソマー

海洋科学研究所 - オケアノス、アゾレス大学、オルタ、ポルトガル

クリストファー・K・ファム & ヤスミナ・ロドリゲス

生物学、アカディア大学、ウルフビル、ノバスコシア州、カナダ

マーク・L・マロリー

カナダ環境・気候変動局生態毒性・野生生物保健課、カナダ、オンタリオ州オタワ

ジェニファー・F・プロベンチャー

マギル大学天然資源科学部、サンタンヌドベルビュー、ケベック、カナダ

ジュリア・E・バーク

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GF は、SSCKP が確保した資金と C. borealis のサンプリング許可の監督の下で、研究を概念化し、設計し、実験室での作業を実施し、データを分析し、原稿を執筆しました。 YR は C. borealis に関連するデータを収集しました。 MLM と JFP は資金と F. glacialis のサンプリング許可を確保した。 MLM、JFP、および JEB は、F. glacialis に関連するデータを収集しました。 SS は、ウルム大学が支援する野生動物健康プログラム内でのマイクロバイオーム関連のすべての実験室分析のための資金を確保しました。 著者全員が原稿をレビューし、編集しました。

グロリア・ファッケルマンまたはシモーネ・ソマーへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Ecology & Evolution は、この研究の査読に貢献してくれた Lauren Roman、Antton Alberdi、およびその他の匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

コリーミズナギドリは、アゾレス諸島の北大西洋の亜熱帯循環の端で収集され (ポルトガル、濃い緑色の点、分布は緑色で示されます)、キタフルマルは北西大西洋のヌナブト準州キキクタルジュアク付近で収集されました (濃い紫色の点、分布は図で示されます)。紫）。

各サンプル内の門 (85 羽の海鳥から得られた n = 169 サンプル) は、y 軸上の相対存在量によってプロットされています。 存在量の少ない門 (有病率 < 0.1、存在量 < 10) はグループ化され、「その他」としてラベル付けされます。

各ドットは、胃腸管内の位置（青色のドット、n = 85）または総排泄腔マイクロバイオーム（オレンジ色のドット、n = 84）のいずれかからのマイクロバイオーム サンプルを表します。 アルファ多様性メトリック アレンの H メトリックは、a MP 数の比率 (MP 数/個々の鳥の質量)、および b MP 質量の比率 (MP 質量/個々の鳥の質量) に関してプロットされます。 各プロットの線は、アルファ ダイバーシティ メトリックの線形混合モデルに基づく予測値を示し、線の両側にある影付きの領域は 95% 信頼区間の上限と下限を示します。

a、b 重み付き UniFrac 距離を使用した主座標分析 (PCoA) 順序プロット、c、d 重み付けされていない UniFrac 距離、およびユークリッド距離を使用した e、f 主成分分析 (PCA) 順序プロット (Aitchison のアプローチ)。 各ドットは、（a、c、e）MP 数の比率（MP 数/個々の鳥の質量; n = 169）および（b、d、f）MP 質量の比率によって連続スケールで色付けされたマイクロバイオームサンプルを表します（ MP 質量/個々の鳥の質量; n = 169)、マゼンタ色の矢印は MP 効果の方向を示します。

a、b 加重 UniFrac 距離を使用した PCoA プロット、c、d 加重なし UniFrac 距離、および e、f ユークリッド距離を使用した PCA プロット (Aitchison のアプローチ) は、海鳥の前胃に対する MP 数の影響を示しています (a、c、e; n = 85)。対総排出腔（b、d、f; n = 84）の微生物ベータ多様性。 各ドットは、MP 数の比率 (MP 数/個々の鳥の質量) によって連続スケールで色付けされたマイクロバイオーム サンプルを表し、マゼンタの矢印は MP 効果の方向を示します。

a、b 加重 UniFrac 距離、c、d 加重なし UniFrac 距離、および e、f ユークリッド距離 (Aitchison のアプローチ) を使用した PCoA プロットは、北フルマにおける GIT 微生物ベータ多様性に対する MP 数の影響を示しています (a、c、e) ; n = 27) 対 コリーミズナギドリ (b,d,f; n = 58)。 各ドットは、MP 数の比率 (MP 数/個々の鳥の質量) によって連続スケールで色付けされたマイクロバイオーム サンプルを表し、マゼンタの矢印は MP 効果の方向を示します。

a、b 加重 UniFrac 距離を使用した PCoA プロット、c、d 加重なし UniFrac 距離、および e、f ユークリッド距離を使用した PCA プロット (Aitchison のアプローチ) は、海鳥の前胃に対する MP 質量の影響を示しています (a、c、e; n = 85)。対総排泄腔（b、d、f; n = 84）の微生物ベータ多様性。 各ドットは、MP 質量の比率 (MP 質量/個々の鳥の質量) によって連続スケールで色付けされたマイクロバイオーム サンプルを表し、マゼンタの矢印は MP 効果の方向を示します。

a、b 加重 UniFrac 距離を使用した PCoA プロット、c、d 加重なし UniFrac 距離、および e、f ユークリッド距離を使用した PCA プロット (Aitchison のアプローチ) は、北フルマにおける GIT 微生物ベータ多様性に対する MP 質量の影響を示しています (a、c、e) ; n = 27) 対 コリーミズナギドリ (b,d,f; n = 58)。 各ドットは、MP 質量の比率 (MP 質量 /個々の鳥の質量) によって連続スケールで色付けされたマイクロバイオーム サンプルを表し、マゼンタの矢印は MP 効果の方向を示します。

補足結果。

各 Excel スプレッドシートに含まれる各テーブルの凡例。

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転載と許可

ファッケルマン、G.、ファム、CK、ロドリゲス、Y. 他現在のマイクロプラスチック汚染レベルは、野生の海鳥の腸内マイクロバイオームに影響を与えています。 Nat Ecol Evol 7、698–706 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41559-023-02013-z

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受信日: 2022 年 4 月 21 日

受理日: 2023 年 2 月 14 日

公開日: 2023 年 3 月 27 日

発行日：2023年5月

DOI: https://doi.org/10.1038/s41559-023-02013-z

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