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May 01, 2023

珪藻への真菌の寄生は地層と生物を変化させる

Edizione di biologia della comunicazione

Communications Biology volume 6、記事番号: 206 (2023) この記事を引用

1381 アクセス

1 引用

3 オルトメトリック

メトリクスの詳細

植物プランクトンは、多様な水生システムにおける水生食物網と元素循環の基礎を形成します。 しかし、植物プランクトン由来の有機物の運命は、複雑に絡み合った再石灰化と沈降のプロセスによって制御されているため、未解決のままであることが多い。 今回我々は、植物プランクトンに感染する真菌寄生虫という、沈下有機物フラックスに関するあまり考慮されていない制御機構を研究する。 我々は、培養モデル病態系（珪藻シネドラ、真菌微寄生虫ザイゴフリクティス、および共生細菌）における非感染細胞と比較して、真菌感染植物プランクトン細胞では細菌の定着が3.5倍、さらには17倍以上促進されることを実証します。野外でサンプリングされた個体群（プランクトトリクス、シネドラ、およびフラギラリア）。 Synedra-Zygophlyctis モデル システムを使用して得られた追加のデータにより、真菌感染により凝集体の形成が減少することが明らかになりました。 さらに、同様のサイズの真菌感染凝集体と非感染凝集体では、炭素呼吸が 2 倍高く、沈降速度が 11 ～ 48% 低くなります。 私たちのデータは、寄生虫が単細胞から単一集合体のスケールで植物プランクトン由来の有機物の運命を効果的に制御し、淡水系および沿岸系における再石灰化を促進し、堆積を減少させる可能性があることを示唆しています。

植物プランクトンは急速に成長し、週に 1 回バイオマスを更新し、水生生物圏の水柱に数ギガトンの腐敗した有機物を残します 1,2。 この腐敗した有機物のほとんどは有光層内で再石灰化されますが、重要な部分は淡水 3,4 や沿岸環境 5,6 を含むさまざまなシステムの沈降粒子物質としてより深い層に輸出されます。 これにより、粒子状有機物は水柱を通って堆積物に向かって輸送されます。これは、底生と遠洋の結合、つまり、遠洋と底生の生息地の間でのエネルギー、質量、栄養素の交換を促進するメカニズムです。 このように、有機物の沈下は、受光層以下で生命を維持する7一方、有機物の再石灰化による酸素消費量が利用可能な酸素供給量を超える地域では、世界中で酸欠水域の拡大につながる可能性がある8、9、10。 したがって、植物プランクトン由来の有機物の運命は、水生食物網と生物地球化学サイクルの鍵となります。

開花後、植物プランクトンの細胞は、糞便ペレットやその他の残骸とともに凝集して、湖雪またはマリンスノーと呼ばれ、1 日あたり最大数百メートルの速度で急速に沈みます11。 この点において、沈下骨材は深さまでの（無）有機物の主な輸送手段である12。 凝集体の形成、再石灰化、沈降は一般に物理的プロセスと生物学的プロセスによって説明され、後者は動物プランクトンの捕食、細菌分解、ウイルス溶解と密接に関連しています12、13、14、15、16。 しかし、最近のデータは、有機物の垂直フラックスに関する生物学的制御メカニズムのネットワークにおいて、いくつかの重要なリンクがまだ欠けていることを示唆しています17。 例えば、水生菌類は、高山の湖 20 から沿岸地域 21 、深海 22 まで、さまざまな水系に豊富に存在し活動しています 18,19 が、この文脈ではほとんど考慮されません。 たとえば、ツボカビと呼ばれる真菌部門ツボカビ門のメンバーは、植物プランクトン細胞上で微小寄生虫として繁殖することができます。 これらのツボカビは湖で、特に宿主の存在量が多い開花期に伝統的によく記録されています 24,25。 さらに最近では、チリ沖の生産性の高い湧昇地域 26、北極海 27,28、地中海での有害な藻類の繁殖期 29 など、顕微鏡で観察されたことにより、沿岸系でも注目が高まっています。 ハイスループット配列決定法を使用して、ツボカビは他の海洋地域でも検出されており 30、31、32、33、34、DNA に基づいたツボカビの存在量は、沿岸地域における植物プランクトンのブルームまたはクロロフィルと相関している 33、35、36、37。 38. したがって、ツボカビは、底生と遠洋の強い結合が一般に想定されている淡水域および沿岸地域で頻繁に発生します7,39が、外洋地域では、これまでのところまれな観察でその分布はあまり明らかではありません40。

寄生性ツボカビは、珪藻、渦鞭毛藻、シアノバクテリアを含む特定の植物プランクトン宿主集団の 1 ～ 44%24、さらには 80 ～ 100% に感染します。 それにより、それらは植物プランクトン個体群の動態を変化させ44、有機物の再石灰化と沈降に影響を与えると推定されています45。 自然の湖では、ツボカビに感染した植物プランクトンは主に表層水で分解するのに対し、感染していない細胞は深さに沈着することが示されています41。 さらに、感染した宿主集団からの光合成由来の炭素の 20 ～ 25% が寄生性ツボカビに（真菌シャントを介して）46、さらに動物プランクトン（マイコループを介して）47 に送られると推定されています。 したがって、ツボカビは水生食物網と元素循環の不可欠な部分であると提案されています 23,48。 しかし、凝集体形成や有機物の垂直フラックスの観点から植物プランクトンバイオマスの運命に及ぼす影響は依然として不明である。

珪藻は、急速に沈下する集合体を形成し 49,50、多くの場合、粒子の輸送の高い割合を媒介する 51,52 が、淡水系および沿岸系では真菌感染の影響を非常に受けやすい 26,28,44。 そこで我々は、利用可能な数少ない珪藻-寄生虫モデル病態系（淡水珪藻SyedraとツボカビZygophlyctis）53の1つを用いて、沈下珪藻集合体とそれに関連する有機物フラックスの形成と特性に対する真菌感染症の影響を調査した。 ここでは、細胞凝集、質量密度、沈降速度、粘着性ポリマー、細菌の定着、呼吸などのパラメータを検討しました。これらのパラメーターはすべて有機物の再石灰化と沈降のプロセスに密接に関連しています。 さらに、我々は、野外でサンプリングされた植物プランクトン群集から形成された集合体における細菌の存在量と感染症の蔓延の分析によって、これらの培養ベースの調査を補完しました。 我々の結果は、真菌性微小寄生虫の蔓延は、水生生物圏における有機物フラックスに対する一時的に影響を与える制御機構として評価される必要があることを示している。

培養珪藻 Synedra sp. から得られたデータ。 およびツボカビ Zygophlyctis planktonica の病理系はモデル系として示され、フィールドサンプリングされた集団からのデータは自然系として示されています。

非感染珪藻とツボカビ感染珪藻の共培養をインキュベートしました。以下、それぞれ非感染処理、真菌感染処理とします。 どちらの培養処理にも、淡水の羽状珪藻である Synedra と共生細菌が含まれていました。 指定された感染症治療法にはさらに、シネドラ関連胞子嚢と自由生活遊走子を発生させる寄生性ツボカビ Zygophlyctis も含まれており、どちらもこの真菌微小寄生虫の生活環の一部です 53。 両方の処理の 1 セット (それぞれ 3 回ずつ) を増殖させ、9 日間の増殖期間にわたってサブサンプリングして、培養の発達 (培養と呼ばれる) をモニターしました。 追加のセットを 6 日間増殖させた後、回転シリンダーに移し、凝集体の形成と特性を分析しました (回転シリンダーと呼ばれます)。 以下で使用される記号、用語、略語は、補足ボックス S1 にまとめられています。

細胞の計数では、非感染細胞、初期感染細胞、成熟感染細胞、感染後細胞、および崩壊中のシネドラ細胞を区別しました (図 1)。 非感染シネドラは、クロロフィル自家蛍光を有する健康な無傷の細胞として認識されました。 初期に感染したシネドラは被包遊走子を示し、これは成熟感染細胞上で成熟胞子嚢（目に見える遊走子を含む）に成長しました。 感染後のシネドラ細胞は、遊走子の放出後に以前の感染の兆候としてキチン質の細胞壁の残存を示しました。 腐敗した細胞はクロロフィルの自家蛍光を示さず、以前の感染の兆候も示さなかったため、真菌感染を受けていない可能性が最も高くなります 46。

a 非感染（非感染）の健康な珪藻細胞。 b 被包遊走子を有する感染珪藻（シスト、初期感染）。これは内部に新しい遊走子を含む成熟胞子嚢（マット sp、成熟感染）に発達します。 遊走子は最終的に周囲水中に排出され、生存不能な宿主細胞上に空の透明な胞子嚢（空のsp、感染後）を残します（d）。 明視野画像と落射蛍光 (蛍光) 画像を示します。 胞子嚢は青色 (Calcofluor White で染色)、珪藻葉緑体は赤色 (クロロフィル自家蛍光) で表示されます。 スケール バーは 20 μm (すべてのパネルに適用)。

9日間の増殖期間中、総シネドラ存在量は約0.8×104細胞mL-1から3×104細胞mL-1に増加し（図2a、b）、指数関数的増殖（日）中の非感染シネドラ集団と感染シネドラ集団の増殖速度は同様でした。それぞれ0〜4、0.26 ± 0.02および0.26 ± 0.02 d−1、P = 0.64、t検定、N = 3インキュベーションフラスコ、補足図S1も参照）。 感染治療では、感染率（初期感​​染、成熟感染、および感染後のシネドラ細胞を含む）は6日目に47％に達し（大部分が成熟感染細胞）、9日目まで同じ割合を維持しました（大部分が感染後） -感染細胞、図2b)。 クロロフィル a の時系列データは、感染培養物と非感染培養物の間で有意に異なり (P < 0.0001、一般化線形混合モデル GLMM、F4,16 = 217.63)、0 ～ 2 日目の両方の処理でクロロフィル a 含有量は同様でした (P > 0.05、t 検定、N = 3 フラスコ）、4 ～ 9 日目では感染培養物と非感染培養物のクロロフィル a 含量が有意に低下しました（例、9 日目：9.5 ± 1.2 および 30.1 ± 1.7 ng chl a mL-1 、それぞれ、P < 0.001、t 検定、N = 3 フラスコ、図 2c)。 栄養素濃度 (9 日目のインキュベーション終了時に分析) は両方の培養処理で同様でした (NO3- + NO2-: 225 ± 2 および 243 ± 9 µmol L-1、P = 0.07; 可溶性反応性リン: 31 ± 2 34 ± 3 μmol L-1、P = 0.32、溶存有機炭素: 非感染および感染処理でそれぞれ 332 ± 24 および 299 ± 11 μmol L-1、P = 0.12、t 検定、N =フラスコ3個）。

非感染培養物 (a) および真菌感染培養物 (b) における珪藻の存在量と感染有病率、c クロロフィル a、d TEP および e CSP 濃度を 9 日間にわたって監視しました。 積み上げバー a、b には、平均値 (バーの高さ) と 3 つのデータ ポイント (円) および標準偏差 (誤差バー) が表示されます。 c〜eのデータは単一のデータ点として表示され、線は連続する時点の平均値を結んでいます（平均値の記号は表示されません）。 各グラフの右上隅に表示される P 値は、両方の治療における各パラメーターの時系列全体間の統計的に有意な差を示します (GLMM)。 単一時点での治療間の統計的に有意な差はアスタリスクで示されます (*P < 0.05、***P < 0.001)。 a–e N = 3 インキュベーションフラスコ。 c–e 青と赤の項目は、それぞれ非感染培養物と感染培養物からのデータを表します。 TEP 透明エキソポリマー粒子、CSP クーマシー ブルー染色可能粒子、XG 等価物キサンタンガム相当物、BSA相当物。 ウシ血清アルブミン同等物。

透明エキソポリマー粒子 (TEP) およびクマシーブルー染色可能粒子 (CSP) は、顕微鏡および分光測光法によって測定されました 54、55、56。 測光分析されたTEP濃度は、両方の治療で6日目まで増加し、その後減少しました（範囲：0.07〜0.75μg XG equ. mL-1、図2d）。 しかし、TEP 濃度の時間依存性の推移は、治療間で有意に異なりました (P = 0.005、GLMM、F4,16 = 5.618)。 TEP 濃度は、非感染治療と比較して、感染治療では 2 日目には有意に高かった (P < 0.001) が、9 日目には有意に低かった (P = 0.04、ペアワイズ比較)。 他のサンプリング日では、両方の処理間に有意差は検出されませんでした (P > 0.22)。 TEP濃度と同様に、CSP濃度は6日目まで増加し、その後減少しました（範囲：0.07〜0.39μg BSA当量mL-1、図2e）が、治療間で統計的に有意な差は検出されませんでした（GLMM、F4のP = 0.34） ,16 = 1.2145 および単一サンプリング日間のペアワイズ比較の P > 0.09)。 顕微鏡法による TEP および CSP の数は非常にばらつきがあり、119 ～ 3,672 TEP mL-1 (dTEP = 2 ～ 4 µm、A = 3 ～ 12 µm2) および 966 ～ 21,196 CSP mL-1 (dCSP = 3 ～ 6μm、A = 9〜32μm2）両方の培養処理で（範囲は0〜9日目の平均値を表し、データは補足データ6にリストされています）。 治療間で TEP および CSP のサイズおよび面積に統計的に有意な差は検出されませんでした (P > 0.13)。

蛍光顕微鏡を使用して、(ii) 非感染、(iii) 初期感染、(iv) 成熟感染、(v) 感染後との関連に基づいて、(i) 自由生活細菌および珪藻関連細菌を列挙しました。 -感染、および(vi) 腐敗したシネドラ細胞。 9 日目、珪藻関連細菌の存在量は、非感染シネドラ細胞と組み合わせて最も少なく (6.5 ± 4.2 細菌珪藻 -1)、感染初期から成熟感染、感染後、感染段階の増加に伴って増加しました。および崩壊中のシネドラ細胞（それぞれ9.9±10.5、9.6±7.2、16.1±12.0、および24.2±13.7細菌珪藻-1、図3a）。 シネドラの同じ細胞段階では、非感染培養では感染培養よりも少ない細菌が定着しました（非感染シネドラ細胞あたりそれぞれ 3.1 ± 2.2 および 6.5 ± 4.2 細菌、そして 1 細胞あたり 17.8 ± 15.3 および 24.2 ± 13.7 細菌）それぞれ崩壊するシネドラ細胞）。 その結果、感染培養物中には珪藻関連細菌が合計で 3 倍多く存在していました (図 3b)。 自由生活細菌の量は時間の経過とともに増加し、感染培養物では 4 日目 (P = 0.0004) と 6 日目 (P = 0.0001) で有意に高い量に達しました。 しかし、9日目には、自由生活細菌の量は両方の処理で同様でした（P = 0.59、t検定、N = 3インキュベーションフラスコ、図3c）。

9 日目の個々のシネドラ細胞あたり (a) および培養体積あたり (b) の珪藻関連細菌の量を示します。細菌は、さまざまな感染段階の個々のシネドラ細胞との関連に基づいてグループ化されました。 （a）の文字a〜dは、有意に異なるグループを示します（Kruskal-Wallis、 P < 0.05、N =分析されたシネドラ細胞の数）。 データは、単一のデータ ポイント (白塗りの円)、25、50、および 75 パーセンタイル (灰色のボックス)、平均値 (青と赤の塗りつぶしの円)、および分布曲線 (カーネル スムージング) として表示されます。 前回のサンプリング日 0 ～ 6 のデータは補足データ 2 にリストされています。b の積み上げバーは個々のサンプルの反復を表します。 c 自由生活細菌が豊富に存在する。 単一のデータ ポイントが円としてプロットされ、時間の経過に伴う平均値が線で結ばれます (平均値のシンボルは表示されません)。 自由生活細菌の存在量の時系列データは、両方の処理間で有意に異なりました (P = 0.012、GLMM、F4,16 = 4.591)。 青と赤の項目は、それぞれ非感染培養物と真菌感染培養物からのデータを表します。 単一時点での統計的に有意な差はアスタリスクで示されます (***P < 0.001)。 b、c N = 3 インキュベーションフラスコ。

凝集体の形成は、真菌寄生虫の存在下で大幅に減少しました。つまり、真菌感染したシネドラ処理と非感染したシネドラ処理では、凝集体の量が少なく、小さくなりました（図4a〜d）。 詳細には、凝集体形成の最初の 12 時間の間、小さな凝集体 (d = 0.4 ～ 1.3 mm) は 38 ± 14 倍少なく (範囲: 20 ～ 58 倍、# L-1)、46 ± 24 個の凝集体で構成されていました。真菌感染シネドラ処理における累積凝集体積（範囲：13〜78倍、mm3 L−1、N = 5時点）の倍。 その後、大きな凝集体 (>1.3 ～ 5.6 mm) も豊富になり、両方のサイズ クラス (d = 0.4 ～ 1.3 mm および >1.3 ～ 5.6 mm) の量は 6 ± 4 分の 1 に減少しました (範囲: 2 ～ 14 分の 1)。真菌感染時の累積凝集体積は 9 ± 7 分の 1 でした (範囲: 3 ～ 25 倍、N = 10 時点)。 最小サイズのビン（d = 0.35〜0.46 mm）内の凝集体が最も豊富でした（非感染処理と真菌感染処理ではそれぞれ最大80個と26個の凝集体L-1、図4e、f）が、大きな凝集体は（d = 2.2〜3.8 mm）は、累積凝集体積の大部分を占めました（非感染処理および真菌感染処理ではそれぞれ最大20および2 mm3 L−1、図4g、h）。

a、b シリンダー回転の最初の 30 時間中の凝集体のサイズ スペクトル。 サイズスペクトルは、各サイズのビンの幅に正規化された水量あたりの凝集体の数を示します。 対数変換を使用して、幅広いサイズスペクトル範囲を視覚化しました。 -1.0 の値は、それぞれのサイズのビンに凝集体が存在しなかったことを示します (つまり、log10(0) が -1.0 に設定された)。 小さな黒い点は、サンプリングされた時点とサイズ ビンをマークします。 c、d 30時間後に記録された粒子画像の例。 e – h 6 時間および 30 時間後に画像化された凝集体の、さまざまなサイズのビンの凝集体濃度と体積スペクトルが示されています。 直径は等価円直径 (ECD) を表します。 e ～ h のデータは単一のデータ ポイント (三重) として示され、線は連続する時点の平均値を結んでいます (平均値の記号は表示されませんが、エラー バーは標準偏差を表します)。 白丸および黒丸は、6 時間および 30 時間後のデータを示します。 イメージングのセットアップを補足図S2に示します。 補足図S3は、サンプリング後に画像化された例示的な凝集体と、感染治療で45時間後の凝集状態を示しています。

私たちは、回転シリンダーから個々の凝集体をサンプリングして、その生物物理学的特性を分析しました。 これらの凝集体はサイズが類似しており、平均直径は非感染凝集体で 2.4 ± 1.3 mm、感染凝集体で 2.4 ± 1.0 mm でした (P = 0.93、t 検定、表 1)。 細菌は、真菌感染凝集体では非感染凝集体よりも 5 倍豊富でした（12.3 ± 0.8 × 104 および 2.7 ± 0.5 × 104 細菌 agg-1、P < 0.0001、t 検定、図 5a）。側面。 第一に、珪藻関連細菌の存在量は、非感染シネドラで最も低く、初期感染、成熟感染、感染後、および腐敗中のシネドラで連続的に増加しました（0.8〜18.8細菌珪藻-1、図5b）。 そして第二に、真菌感染細胞は周囲水と比較して凝集体内で1.7倍濃縮されました（感染率はそれぞれ71±3％および42±3％、P <0.0001、t検定、図5c）。 この濃縮は主に感染後の細胞によるもので、周囲水と比較して凝集体内で 2.6 倍豊富でした（相対存在量 51 ± 6% および 19 ± 3%、P < 0.0001、t 検定、図5d）。

凝集体全体 (a) および単一のシネドラ細胞 (b) 上の細菌の存在量、感染率 (c)、凝集体内および周囲水中のさまざまなシネドラ細胞タイプの相対存在量 (d)。 a内の細菌は、単一凝集体内の個々のシネドラ細胞タイプとの関連に基づいてグループ化されました。 b 内の文字 a ～ e は、有意に異なるグループを示します (Kruskal-Wallis、P < 0.05)。 N は分析された細胞の数を示します。 b のデータは、単一のデータ ポイント (白い円)、25、50、および 75 パーセンタイル (灰色のボックス)、平均値 (青と赤で塗りつぶされた円)、および分布曲線 (カーネル スムージング) として示されています。 a、d の積み上げバーは個々の反復を表します。 単一凝集体の質量密度 (e)、沈降速度 (f)、および呼吸速度 (g、h)。 f 沈降速度は凝集体の直径と正の相関がありました。 適合曲線 (検出力関数) は、両方の治療間で有意に異なりました (P = 0.04)。 青と赤の項目は、それぞれ非感染集合体と真菌感染集合体からのデータを表します。 g μmol agg-POC あたりの nmol O2 × h として与えられる呼吸速度は、mol の凝集体-POC および時間あたりの酸素消費量を定義します。 0.1 d-1 の速度は、1 日あたり集合 POC の 10% が呼吸されたことを示します。 h さまざまなサイズの骨材について推定された、測定されたメートルあたりの呼吸数。 0.1% m-1 の速度は、沈降 1 メートルあたり 0.1% の凝集体 POC が呼吸されたことを示します。 c、e、g のデータは、単一のデータ ポイント (白丸)、25、50、および 75 パーセンタイル (白ボックス)、および平均値 (黒丸) として示されています。

凝集体の質量密度 ρs-agg、すなわち水和凝集体中の粒状物質の密度（固体水和密度とも呼ばれる）57 は、感染凝集体よりも非感染凝集体の方が有意に高かった（1.284 ± 0.003 および 1.258 ± 0.004 g）。それぞれ cm−3、P < 0.0001、t 検定、図 5e、表 1)。 同様に、単一細胞ρs細胞の質量密度は、感染シネドラ細胞よりも非感染シネドラ細胞の方が有意に高かった(それぞれ1.269±0.001および1.251±0.004 g cm-3、P = 0.002、t検定、表1)。 。 周囲の水と比較して過剰な凝集体の質量密度として定義される過剰密度も、真菌感染凝集体と比較して非感染凝集体の方が有意に高かった（0.8 ± 0.3 および 0.6 ± 0.1 mg cm-3、ウェルチ検定） 、P = 0.009、サイズ超過密度曲線のフィットについては補足図S4aを参照してください）。 沈降速度は 52 ～ 534 md-1 の範囲であり、凝集体サイズの増加とともに増加しました。 サイズ-沈降速度曲線の適合（58によって使用されるパワー関数）は、非感染凝集体と感染凝集体の間で有意に異なりました（P = 0.04、曲線適合を比較するF検定、F1,22 = 3.651、図5f）。 凝集体のフラクタル幾何学を表すフラクタル次元 D3 は、真菌感染凝集体よりも非感染凝集体の方が有意に低かった (2.37 ± 0.30 および 2.64 ± 0.24、P = 0.005、表 1)。感染した凝集体の多孔質構造（D3を導出するために使用された曲線フィットについては補足図S4bを参照）。 しかし、この兆候は、非感染凝集体と感染凝集体の同様の空隙率（表1）、および非感染凝集体と感染凝集体の沈降速度の速さ（図5f）によっては確認されませんでした。 炭素含有量は、同様のサイズの両方の凝集体タイプで同様でした（6.7 ± 2.8 および 8.0 ± 5.3 μg POC agg-1、P = 0.52、t 検定）が、炭素固有の呼吸速度は真菌の方が平均して 2 倍高かった。非感染凝集体と比較した感染凝集体（0.16±0.08および0.34±0.08d-1、P = 0.0002、t検定、図5g）​​。 これらの呼吸数は、以前に測定された研究室で形成された骨材および野外でサンプリングされた骨材の呼吸数（およその範囲: 0.06 ～ 0.13 d-1）6,57,59,60,61,62,63 と比較して高いです。 沈降速度が遅く、呼吸速度が高いため、感染骨材は非感染骨材に比べて沈降1メートルあたり2.4〜3.7倍の炭素を呼吸すると推定されました（直径範囲：1〜5 mm、図5h）。

私たちは、温帯の湖（ステクリン湖）で天然の植物プランクトン群集をサンプリングしました。これは、ほとんどが糸状ラン藻（プランクトトリクス、398 ± 74 フィラメント mL-1 およびアファニゾメノン/シューダナベナ、合計 443 ± 11 フィラメント mL-1）と珪藻（シネドラ 280 ± mL-1）で構成されていました。 63 細胞 mL-1 とステファノディスカス/フラギラリア、合計 1382 ± 345 細胞 mL-1)。 ツボカビ感染は、プランクトトリクス、シネドラ、およびフラギラリア細胞で最も高かったため、これらの分類群をより詳細に検査しました（サンプリング中の感染有病率は約 2% でしたが、シネドラとフラギラリアでは、以前の検査で最大 44% の有病率が観察されていました）。同じ場所）24． 細菌存在量は、感染細胞では非感染細胞よりも 17 倍以上高かった（プランクトトリクス 0.1 ± 1.2 および 13.4 ± 14.8 細菌 100 μm フィラメント -1、シネドラ： 0.9 ± 2.2 および 17.5 ± 20.9 細菌 珪藻 - 1、およびフラギラリア：それぞれ0.5±1.5および8.8±6.3細菌珪藻−1、図6a）。 プランクトトリクスとフラギラリアの場合、真菌に感染した細胞は周囲の水よりも凝集体中に比較的豊富に存在しました (プランクトトリクス: 感染率 3.4 ± 2.7% および 0.2 ± 0.4%、P < 0.001、t 検定、それぞれ N = 30 および 29) ；およびフラジラリア：２．１±１．６％および０．５±１．３％、Ｐ＜０．００１、ｔ検定、Ｎ＝３０および２９、それぞれ、図６ｂ）。 対照的に、感染したシネドラ細胞の相対存在量は、凝集体と周囲水の両方で同様でした (有病率 2.6 ± 3.1% および 2.7 ± 3.5%、P = 0.47、t 検定、N = 30 および 29、それぞれ)。

a 非感染植物プランクトン細胞および真菌感染植物プランクトン細胞上の細菌の存在量。 関連する細菌の数は、フィラメント長 100 μm あたり (Planktothrix)、または珪藻細胞あたり (Synedra および Fragilaria) で示されます。 b 回転シリンダー内での細胞凝集後の周囲水および凝集体における感染率。 N は、分析された細胞の数 a または凝集体と周囲水サンプル b の数を示します。 データは、単一のデータ ポイント (白丸)、25、50、および 75 パーセンタイル (灰色のボックス)、平均値 (青および赤の円)、および分布曲線 (カーネル スムージング) として表示されます。

粒子状有機物の沈降フラックスの理解は、水生科学における長年のフロンティアを示すものである一方、過去 20 年にわたって、これらのフラックスを制御する複数のメカニズムの考察は大幅に拡大しました 14,64,65,66,67。 私たちは、本研究で研究した寄生菌類などの真核生物の微小寄生虫の蔓延は、一般に考えられている細菌の分解、ウイルスの溶解、動物プランクトンの放食に次いで、垂直方向の有機物の流動を弱めることができる追加の生物学的メカニズムとしてみなされるべきであると提案します64,68。 69. 以下の議論では、この提案に基づいて説明します。 ただし、私たちのデータは主に 1 つのモデル システムと淡水環境から得られます。 したがって、我々は、多様な水生系における真核寄生生物に関する今後の研究を奨励し、沈下有機物のフラックスを調節するそれらの可能性を最大限に解明することを奨励する。 さらに、寄生虫感染は、植物プランクトン群集構成 70、動物プランクトン生産 71,72、および炭素リサイクル 46 に対する連鎖的な影響を誘発し、これらはすべて垂直方向の質量流束を変化させることが知られています 6,50,73,74,75,76,77。 したがって、寄生虫の蔓延が沈下有機物フラックスに及ぼす重み付けされた影響は、多種多様なプランクトンネットワークで異なる可能性があり、その変動は私たちが解きほぐし始めたばかりである。

珪藻宿主集団の光合成バイオマスは、非感染培養物と比較して47％の感染有病率で最大3倍低いクロロフィルaによって示されるように、真菌感染中に実質的に減少した（図2c）。 このクロロフィルの減少が実際に光合成活性の​​低下をもたらすかどうかは現在まで定量化されていないが、海藻ではツボカビ感染により光合成効率が低下することが示されている78。 したがって、光合成色素の減少は、深部に輸出される可能性のある光合成バイオマスも減少させる可能性がある。 以前の実験室ベースの研究と一致して、細菌の存在量、特に植物プランクトン関連細菌の存在量は、真菌感染中に培養シネドラ細胞上で最大 3 倍増加しました（図 3a、b）。 ここで我々はこのパターンを野外で採取した集団でも確認し、真菌感染した植物プランクトン細胞と非感染した植物プランクトン細胞での細菌定着のさらに高い（少なくとも1桁の）増加を実証しました（図6a）。 この観察は、培養下での栄養が豊富な条件ではなく、自然界の栄養枯渇条件下での細胞増殖にとってより重要な植物プランクトンと細菌の相互作用によって説明される可能性があります。 細菌は通常、分解し、栄養分を漏洩した植物プランクトン細胞に引き寄せられるため、感染した植物プランクトンへの細菌の定着は細菌の走化性によって促進された可能性があります81、82、83。 さらに、健康な珪藻細胞は、化学シグナル伝達を通じて日和見細菌を積極的に撃退することができます84。この能力は、真菌に感染した宿主細胞が失い、その結果、培養中に細菌が増殖した可能性があります。

寄生虫感染により、沈下珪藻集合体の形成が大幅に減少しました。 例えば、自然系の下向きフラックスを支配する可能性がある 0.5 mm を超える凝集体は、寄生菌が存在しない場合には 6 時間後に存在量 5 L-1 に達しましたが、寄生菌が存在する場合には同等の存在量に達するまでに 12 時間かかりました。現在（図4）。 回転シリンダー内での凝集体の形成は、一般に細胞濃度と細胞間の粘着性に依存します 12、13。 私たちの培養インキュベーションでは、細胞濃度は両方の処理で同様でした（約5000のシネドラL-1、シネドラブルームに似ています87）が、粘着性、つまり2つの細胞が出会ったときに凝固する確率は、おそらく真菌感染中に減少しました。 細胞と粒子の粘着性は、それぞれ酸性多糖類とアルカリ性アミノ酸として広く分類される TEP や CSP のようなエキソポリマーの存在によって増加する可能性があります 88,89。 TEP濃度は、非感染シネドラ培養物と感染したシネドラ培養物で時間の経過とともに大きく異なる動態を示しました（図2d）。 しかし、各サンプリング日の絶対 TEP 濃度の差はわずかであり、真菌感染により TEP の濃度ではなく分子組成が変化したと考えられます。 CSP の濃度は両方の培養処理で同様であり、CSP が TEP90 よりも凝集体形成に関与していないという以前の示唆を裏付けています。

興味深いことに、真菌感染集団では感染細胞が非感染細胞よりも優先的に凝集しましたが、それでも全体の凝集は非感染集団と比較して減少していました。 この観察を説明するために、機械的および化学的粘着性を考慮します91。 機械的粘着性に関しては、感染したシネドラ細胞の外側で真菌の胞子嚢が発達すると、細胞の有効サイズが増加し、粒子間の遭遇率と細胞の絡み合いが増加する可能性があります（補足図S5を参照）。 化学的粘着性に関しては、最近珪藻で示されたように、細胞関連ポリマーと自由懸濁ポリマーを区別する必要があるかもしれません92。 私たちは、真菌感染により多糖類が（1）自由に懸濁しているポリマーが減り、全体の凝集が減少する一方、（2）感染したシネドラ細胞の細胞表面に接着性ポリマーが増え、細胞間の粘着性が高まる方向に変化したと考えられます。 実際、以前に示したように、感染処理で観察された細菌集団のより速い増殖（図 3）は、真菌感染中の有機炭素プールの変化を示しています 79。 さらに、真菌感染症の影響を受ける細菌の活動 46 は、凝集体の形成を促進または阻害することが知られています 93,94。 したがって、我々は、自由に懸濁したポリマーは真菌感染中に自由生活細菌によってより効果的に分解されるのに対し、細胞関連ポリマーは感染後の珪藻の表面に蓄積すると仮説を立てます。 この仮説を検証するには、寄生虫感染時の細胞関連ポリマーと自由懸濁ポリマーの両方の分子組成と粘着性を調査することをお勧めします。

培養中のシネドラ細胞、および野外で採取したプランクトトリクスおよびフラギラリア細胞は、感染していない細胞と比較して、感染すると優先的に凝集しました。 対照的に、野外でサンプリングされた感染シネドラ細胞は、非感染細胞と感染細胞が凝集体および周囲水中に比例して均等に分布していたため、そのような優先的な凝集を示さなかった。 私たちのシネドラ細胞分離株は、フィールドサンプリングされた細胞（ステクリン湖）とは異なる湖（ハウゼー湖）に由来し、それらの形態は異なりました（たとえば、フィールドサンプリングされた細胞は細胞分離株よりも約4倍長かった）。 したがって、植物プランクトンのウイルス感染から知られているように、培養されたシネドラと野外でサンプリングされたシネドラの間の異なる凝集パターンは、属特異的な違い（珪藻特異的な細菌の相互作用を含む）、または株特異的な違いによって生じた可能性があります95。 さらに、培養において、感染後シネドラ細胞は、初期感染細胞および成熟感染細胞よりも高い凝集能を示した(図5)。 したがって、感染段階は、凝集のダイナミクスを調べる際に非常に重要です。 野外でサンプリングされた集団では、異なる感染段階を区別しませんでした（細胞は非感染または感染としてのみ分類されました）が、感染有病率が低いことを考慮すると、野外でサンプリングされたシネドラ集団は流行の初期段階にあったことが示唆されます。ほとんどが初期に感染した細胞です。

宿主細胞の外側での胞子嚢の発達により、珪藻細胞の生物体積は 16 ± 5% (N = 20 細胞、表 1) 拡大し、ほとんどが有機材料であり、文献値によれば密度はかなり低かった (細胞質: 1.10 g)。 cm-3、キチン：1.425 g cm-3）を珪質小胞体（1.82 g cm-3）と比較した96,97。 非感染細胞および凝集体と比較して、感染したシネドラ細胞および凝集体の質量密度が低いことは、より多くの細胞関連ポリマー（TEP など）、凝集体あたりの細胞数が少ない、または細菌が溶解することが知られているためシリカ小胞体が薄いことによってさらに説明される可能性があります。シリカ98。 ストークスの法則 (式 5) に従って、質量密度が低いと沈降が遅くなり、これはデータセット内の 2 つの証拠によって確認されました。 まず、サイズと沈降速度の回帰（図5f）に基づいて、感染した凝集体（有病率71％、d = 1〜5 mm）は、感染していない凝集体よりも11〜48％遅く沈下すると推定しました。 そして第二に、ここで測定された感染凝集体と非感染凝集体のより低い質量密度（密度勾配で測定）とより低い過剰密度（式4）は、両方とも約1.5をもたらすであろう。 サイズと沈降速度の回帰と同様に、感染した凝集体の沈降速度は 30% 遅くなります (ストークスの法則に従う)。 したがって、宿主に関連する胞子嚢は珪藻細胞の細胞サイズを増加させたが、その体積当たりの質量（g cm-3）を減少させ、その沈降を遅らせたと結論付けた。 真菌の蔓延中に凝集体形成が減少し、したがって凝集体が小さくなると、沈下速度にさらに強い影響を与える可能性があります。 例えば、凝集体の最大直径は、非感染処理では 1 mm でしたが、感染処理では 6 時間の凝集体形成後にわずか 0.5 mm でした。 このような凝集体直径の2倍の減少により、沈下速度は3倍遅くなりました（図5fのサイズ-沈降速度回帰による）。

71％の真菌感染細胞を含む凝集体は、同様のサイズとPOC含量を有する非感染凝集体と比較して、1日あたり2倍の炭素含量を呼吸しました（図5g）。 我々は、これらのより高い呼吸数は、真菌感染中の上記の細菌存在量の増加と、寄生している真菌の呼吸によるものであると推測しています。 ツボカビは宿主に関連した胞子嚢として成長し、成熟後、自由に遊泳する遊走子を放出して新しい宿主を探します。 特にこれらの遊走子は、集中的な遊泳と探索行動をサポートするステロールと脂肪酸99,100が豊富であるため、酸素要求量が高いと予想されます。 ここで決定された炭素呼吸速度と沈降速度（図5h）を考慮すると、感染した凝集体（d = 1 mm）では炭素の37％が失われ、非感染の凝集体ではわずか12％（つまり3分の1）しか失われないと大まかに推定されました。 50 メートル沈降後の初期炭素含有量は、真菌感染による輸出効率の大幅な低下を示しています。

まとめると、私たちのインキュベーションにより、真菌感染によりクロロフィル含有量、細胞質量密度、細胞凝集、凝集サイズ、沈降速度が減少するが、単一細胞から単一凝集スケールまでの細菌の定着と炭素呼吸が増加することが明らかになりました（図7）。 。 その結果、真菌感染は、いくつかのメカニズムを通じて有機物のフラックスを堆積の減少と再石灰化の増加に向けて変化させ、生態系全体の底生と遠洋の結合に影響を与えると予想される。 真菌寄生虫が、生産的な湧昇地域 26、商業的大量養殖地域 101、有害な藻類の発生の影響を受ける地域 29 を含む、世界のさまざまな気候帯の水生系に蔓延している 27、28、29、44 ことを考えると、その蔓延はその強さと効率を低下させる可能性があります。自然および人工の水生環境における有機物の垂直フラックス。

青と赤の文字と矢印は、それぞれ真菌による各特性の増加と減少を示します。 珪藻細胞 a と凝集体 b は明るい灰色で、珪藻クロロフィルは緑色で、真菌の胞子嚢と遊走子はオレンジ色で、細菌は濃い灰色で示されています。

モデル病態系は、羽状珪藻宿主である Synedra sp. を構成しました。 Ehrenberg、1830 (Ulnaria102 とも呼ばれる、HS-SYN2 株、l = 87.6 ± 4.1、w = 3.3 ± 0.5、および h = 5.0 ± 0.8 μm、N = 50 細胞) および寄生ツボカビ Zygophlyctis planktonicum (SVdW-株) SYN-CHY1) には、ドイツ北部の湖から単離された宿主関連胞子嚢 (7.5 ± 0.8 μm、N = 20) および遊走子 (d = 3 μm、53 で測定) が含まれます 53。 細菌を珪藻およびツボカビと同時分離し、栄養豊富な培地で数か月間共培養を維持したところ、おそらく共生栄養分類群が選択されたと考えられます46。 珪藻宿主上のツボカビ感染は、自由遊泳する遊走子によって始まり、遊走子は宿主細胞に付着し、被嚢し、根粒系を介して宿主の内部に浸透して消化しながらエピバイオティックな胞子嚢に発達しました53。 (動物園) 胞子嚢内では、次世代の遊走子が形成され、最終的には胞子嚢の破裂によって放出されます。 1 回の感染サイクルには 1 ～ 2 日かかりました。 それぞれの感染は致命的であり、宿主のさらなる繁殖を妨げました。

バッチ培養は、CHU-10培地（補足表S1）中で一定温度（17℃）で増殖させました。 明期は 16:8 時間で、16 時間の明期中に 40 μE s-1m-2 を提供しました。 シネドラは、1 L 三角フラスコ中で 12 × 650 mL として約 100 mL に達するまで増殖させました。 7500 細胞 mL-1。 その後、これらのフラスコの半分 (6 × 650 mL) に、成熟真菌胞子嚢を含むシネドラとザイゴフリクティスの共培養液 (40 mL、有病率約 98%) を接種しました。これには、次の時間以内に新しい遊走子が放出されると予想されます (感染した処理）。 結果として得られた感染率は、0 日目の感染処理では 9% でした。他の 6 × 650 mL フラスコは Zygophlyctis なしのままでした (非感染処理)。 経時的な培養の発達を監視するために、6 × 650 mL (処理ごとに 3 つ) を培養し、9 日間サブサンプリングしました (培養特性を参照)。 残りの 6 × 650 mL (処理ごとに 3 つ) を 6 日間増殖させ、その後回転シリンダーに移して凝集体の形成を追跡しました (沈降凝集体の形成と特性評価を参照)。 細胞の再懸濁と水の混合のために、三角フラスコを 1 日 1 回手で穏やかに振盪しました。

サブサンプルは、0、2、4、6、および 9 日後に、非感染珪藻培養物および真菌感染珪藻培養物から (3 連で) 採取されました。 CHU-10培地はすべての分析のブランクとして使用されました。

クロロフィル a および栄養素の分析では、3 mL を 15 mL Falcon チューブに移し、4 °C、3000 rpm で 20 分間遠心分離しました。 上清を静かに除去し、残ったペレットを90％アセトンで抽出し、-20℃で凍結し、1か月後に蛍光光度計（436/680 nm、日立蛍光分光計 F-7000）を使用して分析しました。 クロロフィル a の濃度は、酸性化後に測定され、フェオ色素について計算および補正されました 103。 キャリブレーションは、クロロフィル a 標準 (Anacystis nidulans、Sigma C6144、0.3 ～ 300 ng mL-1、精度 ±1%) を使用して行われました。 硝酸塩/亜硝酸塩および可溶性反応性リンの濃度は、フローインジェクション分析 (FIA) および分光検出 (それぞれ ISO-13395-D28 および ISO/DIS-15681-2) によって 0.45 μm ろ過水から測定されました。 溶存有機炭素 (DOC) の濃度は、燃焼触媒酸化を使用して、非分散赤外線センサー (島津製作所、京都、日本) を備えた TOC-V CPH で GF/75 ろ過水から分析されました。

珪藻の存在量と感染症の有病率は、2 mL のサブサンプルから分析され、微量遠心管に移され、ルゴールで保存され（100 mL サンプルあたり 50 μL、ルゴールのレシピについては補足表 S1 を参照）、暗所で 4 °C で保存されました。 。 シネドラ細胞は、倒立落射蛍光顕微鏡 (Nikon Ti2-E、倍率 400 倍) の下、Utermöhl プランクトン チャンバー (Hydrobios、ドイツ) で計数されました。 胞子嚢のキチン質細胞壁を Calcofluor White (CFW、5 μg mL-1、励起波長 Ex 387/11、発光波長 Em 442/46 nm、Merck F3543) で染色しました 104。 シネドラ細胞は、(i) 非感染細胞、(ii) 初期感染細胞、(iii) 成熟感染細胞、(iv) 感染後細胞、および (v) 崩壊細胞として区別されました (細胞型 i ～ iv については図 1 を参照) ）。 クロロフィルの自家蛍光をEx 635/18 nmおよびEm 680/42 nmで検査しました。 グループあたり少なくとも 50 個の細胞 (i ～ iv)、または存在する細胞が少ない場合はチャンバーの半分を数えました。

細菌存在量分析の場合、0.5 ～ 1 mL をパラホルムアルデヒド (PFA、最終濃度 1.5%) で保存し、ポリカーボネートフィルター (PC、0.2 μm、25 mm、Whatman) で濾過し、-20 °C で保存しました。 事前の分析では、フィルターを 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI、1 μg mL-1) および小麦胚芽凝集素 (Alexa Fluor™ 488 に結合した WGA、5 μg mL-1、キチン質細胞壁に結合) で染色しました。 、サーモフィッシャーサイエンティフィック W11261)104。 細菌を蛍光顕微鏡（Leitz Leica DMRB）下で倍率×1000で計数した。 各グループおよび複製について、20 個のシネドラ細胞 (付着細菌の場合) または 20 個の計数グリッド (自由生活細菌の場合) を調べて、代表的な平均値 (標準誤差 ≤ 5%) に達しました。

透明エキソポリマー粒子 (TEP) およびクマシーブルー染色可能粒子 (CSP) は、顕微鏡および分光測光法によって測定されました 54、55、56。 分光光度分析用に 22 mL、顕微鏡分析用に 2 mL の容量を PC フィルター (0.4 μm、25 mm、Nucleopore、Whatman) 上で静かに濾過しました (<150 mbar)。 TEP フィルターはアルシアン ブルー (AB、0.02%、pH = 2.5) で 5 秒間染色し、CSP フィルターはクーマシー ブリリアント ブルー G (CBB-G、0.04%、pH = 7.4) で 30 秒間染色しました。 染色後、フィルターを MilliQ ですすぎ、余分な色素を除去し、-20 °C で保管しました。 培養物からの滅菌濾過水 (0.2 μm) をブランクとして使用しました。 分光光度分析の場合、補足方法 S1 に指定されているように、AB は 80% H2SO4 で抽出され、CBB-G は 50% イソプロピルアルコール中の 3% SDS で抽出されました。 TEP 濃度はキサンタンガム (μg XG 相当量 L-1) と比較して報告され、CSP 濃度はウシ血清アルブミン (μg BSA 相当量 L-1) と比較して報告されます。

顕微鏡分析では、染色したフィルターを CytoClear スライド上に置き、顕微鏡 (明視野、倍率 x200) で検査しました。 各フィルターについて、フィルター領域全体にわたる 2 つの横断面に沿って 40 枚の画像がランダムに撮影されました。 画像取得全体を通じて同じ顕微鏡とカメラの設定を使用するように注意しました。 画像解析は ImageJ 1.51p105 で行われました。 画像は背景の不均一な光強度を補正し、別々の RGB チャネルに分割されました。 クロロフィル関連領域と珪藻細胞の輪郭を除去するために、青色のチャネルが赤色のチャネルから差し引かれました。 取得された 8 ビット グレースケール画像の色が反転され、グローバルしきい値が適用されました。 ImageJ の自動粒子分析により、フィルター面積あたりの粒子数 (フィルター容積あたりの粒子数 # mL-1 の計算に使用) と各粒子の断面積 A (等価円直径 ECD の計算に使用) が得られました。球状の幾何学形状を仮定し、直径で表されます)。 ECD < 3 µm の粒子は含まれていません。 TEP および CSP の自動認識は完全ではないため、処理された画像を元の画像と視覚的に比較し、誤って輪郭が描かれた TEP または CSP をデータセットから手動で削除しました。 細胞の輪郭と感染段階は画像ではほとんど見えなかったため、バイアスが生じないよう、細胞に関連する TEP および CSP の輪郭をすべて削除しました。 したがって、顕微鏡分析には自由に懸濁したTEPおよびCSPのみが含まれ、分光光度分析には自由に懸濁したTEPおよびCSPと細胞結合したTEPおよびCSPが含まれました。

珪藻細胞の質量密度を分析するために (6 日目)、10 mL を 15 mL の Falcon チューブに移し、遠心分離しました (3000 rpm、5 分間)。 上清を静かに除去し、細胞を 1 mL CHU-10 培地に再懸濁し、上から下に密度が増加する 6 つの粘性層からなる密度勾配 (1.18 ～ 1.38 g cm-3) 上に移しました。 粘稠な層は、Ludox TM コロイダルシリカ (H2O 中の 50 wt.% 懸濁液、Merck 420778)、スクロース、および蒸留水の混合物を用いて調製されました49。 12 時間後、追加の遠心分離 (3000 rpm、5 分) を実行した後、細胞は、液体中で水和したときの粒子状材料の質量密度 ρs-cells (固体水和密度とも呼ばれます) と同等の密度層に沈降しました 57。 無傷の密度層（肉眼で見える）を 2 mL チューブにサブサンプリングし、4 °C で保存しました。 各サンプルの半分について、密度計 (Anton Paar DMA 38) を使用して質量密度 ρs-cells (g cm-3) を分析しました。 残りの半分は、明視野と UV 励起を組み合わせた倒立蛍光顕微鏡 (倍率 400 倍、オリンパス CKX41、日本) で非感染珪藻細胞と感染珪藻細胞 (CFW 染色後) を計数するために使用されました。

非感染培養物および真菌感染培養物の３つを、感染率が感染処理において５９±３％（Ｎ＝３フラスコ）に達するまで６日間増殖させた。 その後、培養物をCHU-10培地で約1.5倍に希釈した。 5000 細胞 mL-1 (ブルームシナリオ中の細胞存在量に似ています 87) を回転シリンダー (r = 8.5 cm、h = 10 cm、V = 2.3 L、気泡なし) に移し、粘着性と差異による細胞の凝集を模倣します。セトリング動作（セットアップは補足図S2に示されています）。 この技術により、一般に天然骨材よりも大きく、より速く沈む骨材を形成できますが（たとえば、106と比較）、密度、空隙率、組成などの物理的特性は天然骨材に匹敵します107、108。 初期の珪藻量は両方の処理で同様でした（それぞれ 5363 ± 495 細胞 mL-1 および 4765 ± 367 細胞 mL-1、P = 0.17、t 検定、N = 3 シリンダー）。 シリンダーは、ローラーテーブル上で暗闇の中で 17 °C で 1 ～ 2 rpm で回転しました。 凝集体の形成は、Mini Deep-focus Particle Imager (MDPI、Bellamare、La Jolla、CA、USA) を使用して経時的に記録されました。 MDPI は、ピンホールの背後にある近赤外 LED 光源 (A007 インダス スター、LED ダイナミクス、ランドルフ、バーモント州、米国) と一連の同一の平凸コリメータ レンズを使用して、ピンホール間に平行光線を生成する「シャドウグラフ イメージャ」です。 LEDライトポッドとカメラポッド（補足図S2）。 この平行光、つまりテレセントリック光学系を使用すると、レンズ間の位置に関係なく、すべての集合体に焦点が合うことが保証されました109。 2 ～ 9 時間ごとにシリンダーごとに 2 つの画像シーケンスを記録しました。 各シーケンスは少なくとも 1 回転 (50 枚の画像) 継続しました。 2 つの画像シーケンスのサンプリング容量は、シリンダー全体の容量の 30% に等しい 2 × 0.35 L をカバーしました。

画像シーケンスは、TEP および CSP 画像と同様に処理されました (上記を参照)。 骨材は計数、測定され、サイズ クラスに分けられ、上部の直径は下部のサイズ クラスの 1.3 倍でした。 結果として得られた 11 のサイズ クラスは、0.4 ～ 5.6 mm の範囲でした (ECD < 0.4 mm の骨材はデータセットから除外され、ECD > 5.6 mm の骨材は存在しませんでした)。 サイズクラスごとの凝集体の数を数え、凝集体数濃度 N(d) (# L−1) として報告しました。 サイズの関数として個数濃度を説明するために、凝集体サイズ スペクトル n(d) (# L-1 mm-1) は次のように計算されました。

ここで、Δd (mm) は各サイズクラスの幅です (d は ECD に等しい)110。 体積スペクトル nVd は、体積分布を凝集体サイズに対して正規化することによって計算されました。

ここで、Vagg (mm3) は、各サイズクラスの単一骨材の平均体積です111。 Vagg および d (ECD に等しい) は、画像解析から導出された A から、球面幾何学を仮定して計算されました。 回転を停止した後、さまざまな分析のために、個々の凝集体を大口径ガラスピペットで採取しました。 非感染凝集体と感染凝集体で凝集体サイズが同様であることを確認するために、非感染処理から 30 時間後と非感染処理から 45 時間後に凝集体をサンプリングしました（詳細については補足図 S3 を参照）。 すべてのパラメータを同じ集合体で測定できるわけではないため、その後の分析では、集合体を 5 つのセット (セット I ～ V、それぞれ 4 ～ 12 個の複製集合体) にグループ化しました。

セット I は、サイズ、空隙率、過剰密度、沈降速度、およびフラクタル次元の決定に慣れていました。 コンパクトカメラ (Panasonic DMC-TZ22、14 MP) を使用して、サンプリング直後に凝集体を画像化しました。 断面積 A は ImageJ で決定され、球形状を仮定して ECD と体積 V を計算するために使用されます。 気孔率 φ は次のように計算されました。

ここで、Δρ は骨材の過剰密度、ρs-agg は液体中で水和したときの骨材中の粒状物質の質量密度 (固体水和密度) です57。 沈降カラム（d = 11 cm、h = 40 cm）内での骨材の沈降速度 U を測定しました。 カラムには回転シリンダーと同じ水が充填され、同じ温度 (17 °C) に保たれました。 それは二重壁であり、２ｃｍの空間が水で満たされ、凝集体を導入するための２ｃｍの入口を除いて上部が密閉されていた。 この設定により、沈降実験中の塔内の対流が最小限に抑えられました112。 それぞれの凝集体を、大口径ピペットから水中に自由に沈降させました。 ストップウォッチを使用して、15 cm に沿って沈降の時間を測定しました。 凝集体の過剰密度 Δρ は、バラスト処理された植物プランクトン凝集体に適用されるストークスの法則を使用して計算されました 113

ここで、ν は動粘度 (17 °C で 1.085 × 10−2 cm2 s−1)、g は重力加速度 (981 cm s−2) です。 抗力係数 CD とレイノルズ数 Re は次のように導出されます。

集合体の三次元フラクタル数 D3 を使用して、集合体のフラクタル構造を決定しました。 D3 は、対数変換後の d と U の傾きから導出されました (補足図 S4b)112。

セット II は、酸素呼吸と粒子状有機炭素 (POC) の分析に使用されました。 単一凝集体を、回転シリンダーからの 0.2 μm 濾過水とともに 5.9 mL の気密 Exetainer® バイアルに移しました。 酸素濃度は、凝集体を添加した直後および暗所で 17 °C で 24 時間インキュベートした後、Clark 型酸素マイクロセンサー (OX-500、Unisense A/S、デンマーク) で測定しました。 インキュベーション中、Exetainer は回転して凝集体を自由に浮遊させ、凝集体表面での拡散律速のガス交換を最小限に抑えました 114。 酸素消費速度は、1 mol CO2115 に対する 1.2 mol O2 の呼吸商を仮定し、骨材固有の POC 含有量に正規化することにより、炭素固有 (C 固有) の呼吸速度に変換されました。 温度変化などによる酸素濃度の変化は、0.2 μm の濾過水を使用し、凝集物を含まない対照バイアルでテストされました。 観察された酸素濃度の変化は、凝集体を含むバイアルよりも対照バイアルの方が有意に低かった (2 ± 1% および 11 ± 6%、それぞれ N = 6 および 18 バイアル、P < 0.001)。 インキュベーション後、凝集体を事前に燃焼させた GF/F フィルター (25 mm、Whatman) で個別にろ過し、後の POC 分析のために -20 °C で保存しました。 保管後、フィルターを HCl で燻煙させ、50 °C で一晩乾燥させました。 燃焼後の POC は、炭素分析装置 (Surface C-800、Eltra Analysers、0.01 mg C 標準、精度 2%) を使用して分析されました。 炭素呼吸速度は単位d-1および% m-1で与えられ（図5g、h）、それぞれ1日あたりおよび沈降1メートルあたりの単一骨材内の炭素呼吸率を定義します。 再石灰化長スケール L6 とも呼ばれる、設定されたメートルあたりの呼吸数は次のように計算されました。

サイズ-沈降速度曲線の適合（図5f）および1日あたりの平均呼吸数（図5g）に基づいて、d = 1〜5 mmの凝集体について。

セット III と IV は、感染症の有病率と細菌の存在量を決定するのに役立ちました。 単一の凝集体と周囲水 1 mL をサンプリングし、上記のように顕微鏡で検査しました (培養特性のセクションを参照)。 つまり、シネドラ集団の感染率はルゴール保存サンプル（倍率×400）で分析されたのに対し、シネドラ関連細菌の豊富さはPFA保存サンプル（倍率×1000）で分析されました。 顕微鏡下で個々のシネドラ細胞を検査できるように、濾過および/または計数の前に、2 mL 微量遠心管内で穏やかに振盪することによって凝集体を解砕しました。 凝集体関連細菌の数 (凝集体あたり) は、シネドラ細胞タイプあたりの関連細菌の数と、凝集体あたりの各シネドラ細胞タイプの存在量を乗算することによって計算されました。 d = 2.1 ± 0.8 mm (N = 18) で凝集体あたり平均 22,843 ± 34,443 個のシネドラ細胞を数えたため、凝集体あたり 20,000 個のシネドラ細胞と仮定しました。

セット IV を使用して、単一凝集体の質量密度 ρs-agg を導き出しました。 単一の凝集体を密度勾配の上に静かに移しました。 さらなる手順は、ρs 細胞に使用されるプロトコールに似ていました。つまり、遠心分離と沈降の後、凝集体を含む層がサンプリングされ、その質量密度が分析されました (上記、「培養特性」セクションの最後の段落を参照)。

2018 年 4 月の春の開花期に、シュテクリン湖 (ドイツ北部) からプランクトン群集がサンプリングされました。手持ちのプランクトン ネット (メッシュ サイズ 25 μm、Hydro-Bios) を使用して細胞を 0 ～ 10 m の距離で濃縮し、10 L に再懸濁しました。現場の地表水を3つの回転シリンダーに移送します。 巨視的な凝集体 (d = 2 ～ 4 mm) が形成されるまで、シリンダーを暗所で 7.5 °C (現場温度、1.5 rpm) で 12 時間回転させました。 個々の凝集体は大口径ガラスピペットでサンプリングされ、周囲水の一部はプラスチック注射器でサンプリングされました。 各シリンダーから 10 個の複製 (10x 凝集体および 10 x 2 mL 周囲水) をサンプリングし、半分に分割しました。 半分は単一の植物プランクトン分類群の感染率を決定するために保存され、残りの半分は細胞関連細菌をカウントするために保存されました。 サンプルの保存と顕微鏡分析は上記のように実行されました（「培養特性」の項を参照）。

平均値間のペアワイズ比較は、非正規分布データについてはマン・ホイットニー検定、非等分散の正規分布データについてはウェールズ検定、等分散の正規分布データについては t 検定を使用して計算されました (agricolae v. R の 1.3.1)。 正規分布はシャピロ検定を使用して検定され、データ分散は F 検定で検定されました。 複数のグループ間の統計的差異は、クラスカル・ウォリス検定を使用して決定されました（正規分布が拒否された場合は、P 値調整のためのボンフェローニ補正を使用）。 時系列データ間の統計的に有意な差は、一般化線形混合モデル (GLMM、lmerTest v. 3.1.3 in R) に基づいて計算されました。 分散の均一性の仮定が拒否された場合、データは対数変換されました (残差対適合プロットで視覚的に検査されました)。 時系列データのペアワイズ比較は、emmeans (R の v. 1.7.2) を使用して実行されました。 統計テストとプロットは R 3.3.0116 と Origin2021 で行われました。 統計的検定は両側で実行されました。 有意水準は0.05でした。 非常に有意な水準での P 値は、<0.001 または <0.0001 として与えられます。 単一変数の不確実性の組み合わせから導出される不確実性 (±sd) は、誤差伝播の法則に従って計算されました。 反復回数は、結果セクションの各平均値に対して示されます。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

図にプロットされ、本文で言及されているデータは、補足データ ファイル (補足データ 1 ～ 6) にリストされています。 粒子分析に使用される画像と画像処理コードは、Dryad https://doi.org/10.5061/dryad.2rbnzs7s7 からダウンロードできます。 さらにデータをリクエストする場合は、対応する著者に問い合わせる必要があります。

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実験とサンプル分析における多大なご支援を賜りました、Hannah Bachmann、Matthias Bodenlos、Monika Degebrodt、Hannah Gebhardt、Maren Lentz、Uta Mallok、Monika Papke、Solvig Pinnow、Ignacio Rodanes Ajamil、Michael Sachtleben、Kenuke Seto に感謝いたします。 統計上のアドバイスをいただいたChristiane Hassenrückに特に感謝いたします。 資金は、ドイツ科学財団 DFG 助成金 IV 124/3-1 (プロジェクトに資金を提供し IK を支援するために HPG および MHI に) およびエミー ネーター プロジェクト KL 3332/1-1 (プロジェクトに資金を提供し IK を支援するために IK に) によって提供されました。 ）。 さらなる資金は、DFG (培養維持を支援するために HPG に GR1540-33-1)、ヘルムホルツ協会若手研究者グループ SeaPump VH-NG-1000 (CMF および MHI を支援するために MHI に)、AWI 戦略基金プロジェクトによって提供されました。 EcoPump」（CMF を支援するために CMF に）、日本学術振興会（MK を支援するために JSPS 科研費 15KK0026、16H02943、および 19H05667 を MK に助成）、および DFG-Research Center of Excellence「海洋底 – 地球の未知」 「インターフェイス」: EXC-2077-390741603 およびアルフレッド・ウェゲナー研究所ヘルムホルツ極地海洋研究センターの HGF インフラストラクチャー・プログラム FRAM のフレームワーク (MHI をサポートするために MHI に)。 MDPI はドイツ連邦教育研究省 BMB​​F (033W034A to JCN) から資金提供を受けました。

Projekt DEAL によって実現および組織されたオープンアクセス資金調達。

シルケ・ヴァン・デン・ウィンガルト

現在の住所: トゥルク大学生物学部、20014 年、トゥルク、フィンランド

クララ・M・フリントロップ

現在の住所: 8810302、イスラエル、エイラート、エイラートにある大学間海洋科学研究所

カロリーナ システルナス ノボア

現在の住所: オーシャン サイエンス センター、ニューファンドランド記念大学、セント ジョンズ、NL、A1C 5S7、カナダ

プランクトンおよび微生物生態学部、ライプニッツ淡水生態学および内陸水産研究所 (IGB)、16775、シュテクリン、ドイツ

イザベル・クラウォン、シルケ・ヴァン・デン・ウィンガルト、ティム・J・W・ウォーレス、イェンス・C・ネストゴート、ハンス＝ピーター・グロサート

生物海洋学部、ライプニッツバルト海研究所ヴァルネミュンデ (IOW)、18119、ロストック、ドイツ

イザベル・クラウォン

アルフレッド・ウェゲナー研究所 (AWI)、ヘルムホルツ極地海洋研究センター、27570、ブレーマーハーフェン、ドイツ

モーテン H. アイバーセン & クララ M. フリントロップ

海洋環境科学センター (MARUM) およびブレーメン大学、28359、ブレーメン、ドイツ

モーテン H. アイバーセン & クララ M. フリントロップ

ヘルムホルツ海洋研究センター (GEOMAR)、24148、キール、ドイツ

カロリーナ システルナス ノボア

東邦大学理学部、〒274-8510 千葉県船橋市

Maiko Kagami

横浜国立大学環境情報学部、〒240-8502 神奈川県横浜市

Maiko Kagami

ポツダム大学生化学生物学研究所、14469、ポツダム、ドイツ

ハンス・ピーター・グロサート

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概念化: IK と S.Vd.W. 方法論：IK、S.Vd.W.、MHI、TJWW、CCN、JCN、MK、HPG 調査：IK、S.Vd.W.、CMF、MK 可視化：IK 監督：IK、MHI、HPG 原文執筆ドラフト：IK. 校正と編集: IK、S.Vd.W.、MHI、TJWW、CMF、CCN、JCN、MK、HPG

イザベル・クラウォンへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた Trang Nguyen 氏、Kyle Mayers 氏、およびその他の匿名の査読者に感謝します。 主な取り扱い編集者: リン・ホフマンとデイビッド・ファヴェロ。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Klawonn, I.、Van den Wyngaert, S.、Iversen, MH 他。 珪藻への真菌の寄生は、沈下集合体の形成と生物物理学的特性を変化させます。 Commun Biol 6、206 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04453-6

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受信日: 2022 年 10 月 19 日

受理日: 2023 年 1 月 10 日

公開日: 2023 年 2 月 21 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04453-6

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